3.2 等電聚焦（IEF)
各種長度（如 7 cm、13 cm、18 cm、24 cm ) 和不同 pH 范圍的固定化 pH 梯度 ( IPG ) 膠條可供使用。IPG 膠條常在 20℃ 下（溫度低于 20℃ 可導致尿素結晶）于適量水化液中水化過夜（16 h ) 。這可在溶脹托盤 （ re-sweling tray ) 或直接在膠條槽（stripholder) 內完成。無論選取何種方法，必須保證膠條和容器底部間的氣泡都被移除。該步完成后，膠條需覆蓋上不導電的油。如果水化是在溶脹托盤內進行的，還必須轉移到膠條槽上運行。IEF 參數設置取決于膠條長度 ，但始終在 20℃ 完成。若溫度高于 20℃，可能導致蛋白質修飾，如尿素產生的 氰酸銨（ammoniumcyanate) 導致的氨甲酰化 ( carbamylation ) 。一旦等電聚焦完成，瀝去多余的覆蓋油，儲存膠條于 -80°C 。本說明假定使用的儀器是 GE Healthcare IPGphor。
膠條水化
( 1 ) 對于 24 cm IPG 膠條：融化 4 ml 水化液，加入 DTT 和 IPG 兩性電解質至以下濃度：DTT 40 mmol/L；兩性電解質 0.5%（V/V）。
( 2 ) 對于 pH 3~10 的 IEF，加入適量的樣品至水化液中，使每根膠條上樣 400 μg 蛋白質。理想條件下每根膠條須用 50~100 μl 樣品。對于 24 cm 膠條，蛋白質樣品和水化液的總體積應為 450 μl。理想條件下水化液：樣品比例不應小于 3:1。
( 3 ) 無論水化是在 IPG Manifold ( 多功能盤）還是直接在單根膠條槽內進行，用移液器從 24 cm、12 道槽的溶脹托盤（reswelling tray ) 的槽一端加入 450 μl 緩沖液和蛋白質混合液（見注 4) 。
( 4 ) 對于 pH 6~11 間的 IEF，除了兩性電解質以 pH 6~11 代替 pH 3~ 10 外，所用蛋白質和緩沖液的總體積與 pH 3~10 —樣。此外，水化液是從槽一端加入，樣品單獨加在正極端（+ ) 。
( 5 ) 放置干膠條（ ImmobilineDryStrip )，膠面朝下，置于溶脹托盤的槽中，確保膠條下無氣泡。
( 6 ) 用 DryStrip 覆蓋油覆蓋，加蓋封上，20℃ 水化 16~18 h ( 過夜）。
( 7 ) 取走膠條（使用鑷子），去除多余覆蓋油。
( 8 ) 膠面朝上，放入 24 cm IPGPhor Manifold 多功能盤中（ 最多可達 12 根） 。
( 9 ) 將膠條排列在每個槽的中間，以 DryStrip 覆蓋油覆蓋。即使未使用，也要將所有槽內填入覆蓋油。
( 10 ) 潤濕電極濾紙片，吸去多余水分。
( 11 ) 將電極濾紙片置于膠條的兩端，輕微接觸膠條。
( 12 ) 將可移動電極固定于 24 cm IPGPhor Manifold 多功能盤中。將電極置于濾紙片與膠條接觸部分。
( 13 ) 固定好電極位置，蓋上 IPGPhor 電泳儀的蓋子。
( 14 ) IEF 運行的條件必須根據不同的提取物憑經驗決定。但以下參數適用于面粉 /Tris - CaCl2 法提取物：500 V 、1 h；1000 V、1 h；8000 V、8.20 h。總計 65500 Vh。
( 15 ) IEF 結束后，移出膠條，除去多余覆蓋油，將膠條置于 10 ml 塑料吸管中 ( 去掉尖端使膠條能放入）。用封口膜密封，儲存于 -80℃。
3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)
3.3.1 使用儀器為 GE Healthcare Ettan Dalt II
( 1 ) 玻璃板用清潔劑浸泡過夜，去離子水沖洗，再用乙醇和 RO ( 反滲透）水沖洗，風干。
( 2 ) 根據使用說明書將凝膠板組裝（見注 5 關于硅密封膠的使用，如果使用的是非自封的膠板，確保膠板四周完全密封）。
( 3 ) 制備多塊膠時，在每塊凝膠盒間用可重復使用的塑料墊片隔開，將凝膠盒裝入制膠盒。保證凝膠盒緊密填充，且通過用硅脂涂抹橡膠密封墊使前板與灌膠盒形成完好密封。擰緊面板上的螺栓，水平放置灌膠盒。
( 4 ) 接上制膠管和漏斗，用夾鉗和立架保持垂直。
( 5 ) 如使用取代液，漏斗準備就緒后加入 100 ml 替換液至平衡室。如果不使用替換液，在灌膠后可通過用大量 熱水從管內沖走聚合的丙烯酰胺。
( 6 ) 12 塊 10% 的凝膠使用 1 L 凝膠溶液：250 ml 1.5 mol/L Tris - HCl，pH 8.8；333 ml 30% ( V/V ) Duracryl 0.65% (m/V ) bis；407 ml 水。攪拌，置于 2 L 布氏燒瓶中除氣 15 min。
( 7 ) 加入 10 ml 10% (m/V) SDS，稍加攪拌。
( 8 ) 用前加入 2.5 ml 10% APS 和 0.5 ml TEMED，攪拌。
( 9 ) 將丙烯酰胺溶液灌入漏斗，不斷補足（重要的是不能使漏斗中溶液完全流空，否則會在膠內形成氣泡）。持續加液直至膠面離第一塊前板頂端 1~2 cm ( 約 1 L ) 。
( 10 ) 移去漏斗，使替換液向下流入灌膠模具（caster ) 底部的 V 形槽。
( 11 ) 在每塊膠頂端覆蓋 1 ml 水飽和正丁醇，放置 3~4 h 待凝膠聚合。
( 12 ) —旦聚合完成，拆除灌膠盒，移去凝膠盒，用去離子水漂洗凝膠盒以去除水飽和丁醇，以及少量附著在凝膠盒外面上的小塊凝膠。
( 13 ) 配制 1 : 4 ( RO 水）稀釋的 1.5 mol/L Tris-HCl ( pH 8.8 ) 作為凝膠存儲液使用。
( 14 ) 將凝膠置入一個大的塑料盒，加入足夠的凝膠存儲液以完全覆蓋凝膠。
( 15 ) 凝膠在 2~4℃ “成熟” 10~14 天之后可供使用，但從制膠之日起一個月以后不能再用。
3.3.2 凝膠電泳
( 1 ) 每根 IPG 膠條用 10 ml 凍存的預制平衡液，在 4℃ 冰箱或冷室解凍過夜。
( 2 ) 準備 7 L下槽液：25 mmol/L Trizma 堿，15 mmol/L 冰醋酸。
( 3 ) 將緩沖液倒入 Ettan Dalt ll 槽，打開泵冷卻到 15℃。
( 4 ) 準備上槽液：3 L 200 mmol/L Tris 堿，0.4% (m/V) SDS，200 mmol/L Tricine。
( 5 ) 用水沖洗 IPG 膠條去除多余覆蓋油，在含 1% (m/V) DTT 的 10 ml 平衡液中平衡 15 min。
( 6 ) 棄去平衡液，再加入 10 ml 含 4% (m/V) 碘乙酰胺的平衡液溫育 15 min。由于碘乙酰胺感光，管子外要包上鋁箔。
( 7 ) 將第二向膠從冷藏處取出，用上槽液清洗凝膠頂端 3 或 4 次。
( 8 ) 向凝膠盒槽內填灌上槽液，并加載膠條。按慣例，膠條的酸性端是在凝膠的左邊。確保膠條和凝膠間沒有氣泡存在。
( 9 ) 潤濕凝膠盒邊緣，以順利穿過橡膠密封管的通路，將凝膠放入電泳槽。如果不足 12 塊膠，則使用 Perspex空白。
( 10 ) 加入上槽液，避免影響凝膠盒槽，蓋上蓋子，使用以下參數運行： 第 1 步：恒功率= 60 W ( 5 W/膠）；時間 0.15 h；溫度 = 15℃；泵 = 自動。第 2 步：恒功率=120 W ( 10 W/膠）；時間 2 h；恒功率 = 240 W ( 20 W/膠）；時間 6 h；溫度 = 15℃；泵 = 自動。
( 11 ) 當染料前沿離膠底端 0.5~1.0 cm 時停止電泳。總的運行時間約 8 h。
( 12 ) 撬開玻璃盒，每塊凝膠切角以指示方向。將凝膠置入合適的染液（ 見后述 ）。