3.13 實時 RT- PCR 驗證轉錄組數據
有兩種常用的基因（擴增子）定量檢測方法：基因特異熒光探針（如 TaqMan chemistry) 或者特異雙鏈 DNA 結合試劑（SYBR green chemistry ) [22]。我們通過實時 RT-PCR，選擇 SYBR green chemistry 來驗證 cDNA 芯片發現的 DEG 的表達。不同的基因設計特異引物（見注 32) 。
3.13.1 實時 RT- PCR 反應的準備
( 1 ) PCR 用可視化的 96 孔板在 ABIPRISMA 7500 Sequence Detection System 儀器上進行 ( Applied Biosystems， Foster City， CA，USA ) 。
( 2 ) 總 RNA ( 2 μg 脫氧核糖核酸酶處理過的 RNA，來自 3.4 節）用反轉錄酶和緩沖液（Superscript EIRT， Invitrogen ) 按照說明手冊反轉錄。
（3 ) PCR 反應用 25 μl 體系：100 ng cDNA，12.5 μl 2X 帶 SYBR 綠色熒光染料的 Platinum qPCR Super Mix-UDG ( Invitrogen ) ，0.5 μl ROX 參照染料（Invitrogen ) ，一對特異引物（每個引物 200 ng) ( 見注 33 ) 。
( 4 ) 所有 PCR 反應用了如下標準溫度控制：50℃ 2 min , 95°C 2 min , 40 個循環：95℃ 15s 和 60°C 1 min ( 見注 34)。
3.13.2 實時 PCR 數據提取和分析
( 1 ) 原始數據提取。收集每個樣品循環閾值（Ct ) [23]。為了比較不同的 cDNA 樣本的 Ct 值，所有比較基因的 Ct 值都根據看家基因 actin 進行標準化 （見注釋 35) 。
( 2 ) 數據分析。使用 Pfaffl 推薦的方程式計算選擇基因的相對表達量 [24] 。這些算法包括校正基因擴展效率。不同目標基因和參照基因的 PCR 擴增效率估計使用 Ramakers 等 [ 25 ] 推薦的方程式。
3.14 遞交芯片數據到公共數據庫：ArrayExpress
芯片的數據應存放在公共數據庫：ArrayExpress [ 26 ] 是在歐洲生物信息研究所( EBI) 的高通量功能基因數據的公共數據庫 。這個數據庫由兩部分組成：ArrayExpress 庫（MIAME，主要是初級歸檔）和 ArrayExpress 數據 庫（它是不斷注釋的選擇基因表達譜數據庫）。ArrayExpress 是 MGED ( 基因芯片表達數據協會）推薦的三個公共芯片數據庫之一。它以保密的形式存儲文章使用的數據，允許獲得授權的用戶，如期刊編輯和審稿入登錄數據，文章發表后與其相關的數據可以在指定日期公開。一般情況下，芯片數據提交包括 4 個主要步驟：① 創建一個提交用的新賬戶（MX 賬戶）；② 提交程序（芯片制備方案、樣品的生長和提取步驟、樣品標記、雜交，掃描、分析步驟等）；③ 提交芯片設計（ 名稱、設計、技術等） ； ④ 提交實驗 （ 實驗設計、發表的論文、樣品、提取物等）。有關的詳細信息請參閱網頁： http ://www . ebi. ac. uk/ miamexpress/ Help。
3.15 統計模型
剩余最大似然法（REML 法） [ 27 ] 在 GenStat 第 7 版 （ 2003年）統計系統中應用 ，適合于混合模型（ 包括隨機和固定效應），以從任何特定比較（ 如 14dpa 的 B102-1-1與 L88-31 ) 中，每個基因多達 6 個觀察值，建立一套完整的數據集。根據模型偏差估算實驗設計中由生物學重復和技術重復所組成的方差，不同的模型之間進行測試時，隨自由度變化的其方差變化服從 x2 分布。使用 Wald 檢驗 [ 28 ] 評估模型中的固定效應，測試統計量也服從 x2 分布。因此，建模考慮了設計上的變異效應（ 隨機效應）和固定效應 （ 9246 個基因）。經過隨機和固定參數（term) 的顯著性評估，在 14dpa 的 B 102-1-1 和 L 88-31 比較模型是：