3.9 芯片數據介紹
對簡單的實質等同性實驗來說，一個比較轉基因系與對照之間基因表達的散點圖就已足夠了。文獻 [ 5 ] 中參與兩個實驗的樣品都標注在圖15. 2中。結果用 GeneSpring 軟件包顯示，繪制了每組比較小麥系之間每個基因成對的平均強度，并突出顯示少數感興趣的基因（統計上顯著差異表達）。結果也在表15 . 2 中作了數值化總結。
結果表明，轉基因并未影響顯著數量的內源性基因的表達，轉基因植物實質等同于其相應的非轉基因對照或親本[ 5 ] 。結果也證實了轉化方法（ 如干凈片段或者整個質粒）對基因表達模式影響不大。實質等同性實驗強調統計上的嚴謹性，對 cDNA 芯片來說 ，考慮諸如染料偏好性和芯片空間變異等的問題（ 見注20，目前 cDNA 芯片實驗數據分析的評價）。
對于簡單的實質等同性實驗而言，一張簡單的比較轉基因系和對照系之間表達的散點圖就可以了，更復雜的設計可能需要其他的顯示方式。無論是 cDNA、寡核苷酸芯片或者其他平臺，分層聚類是一種有力的轉錄組數據概覽方法 [16]。這種方法將有基因關聯表達的樣品和（或）基因分組，不同的關聯程度以樹狀圖可視化。它通常是以熱圖樣式顯示的：基因樹在一邊，樣品樹在另一邊，顏色代表基因的表達量。如果檢測到處理對表達有影響，不同處理的樣品會表現為不同的分支，所有重復出現在這些分支內的葉片上；在另一維，不同表達的基因也會聚在一起。
基因表達譜的非分層聚類方法，如 K 均值、質量閾值（QT ) 和自組織映射等也是常用到的。基因簇的平均表達值可以簡化轉錄組數據。共表達意味著共同的轉錄調控和潛在的功能關系。進一步檢查基因簇內基因，以確定是否有任何共同的已知功能（如蛋白質儲存、應激反應或防御），或參與共同途徑。對于作物如小麥中的絕大多數基因，功能只可能從序列相似性推測。聚類分析，顯示和注釋工具可以在開放資源 [ 如 Bioconductor (http://www .bioconductor .org / ) ] 和商業軟件包 [ 如 GeneSpring (AgilentTechnologies, Inc) ] 獲得。
3.10 分析小麥基因芯片背景
這里概述了 Affymetrix 基因芯片表達分析應遵循的步驟。詳細的標準流程可以在“ Affymetrix 基因表達分析技術手冊”中查詢（見注 21 ) 。
基因芯片探針芯片是由 Affymetrix 公司制造的（見注 22) 。現在許多大學和私入公司已全面配備 Affymetrix Gene Chip TM 芯片平臺，為客戶提供各種芯片檢測過程服務（GeneChip芯片探針購買、cDNA 標記、芯片雜交、掃描、芯片分析等）。
Affymetrix Wheat Gene Chip 芯片由 AffymetrixGene Chip Consortia Program 制造，包含了 61127 套探針，代表小麥基因組所有 42 條染色體上 55052 個轉錄本。芯片是基于 GenBank 和 dbEST ( http://www.affymetrix.com/community/research/consortia .affx ) 上發表的功能域數據設計的。小麥基因組芯片可用于不同小麥種的基因表達研究： UniGene Build 38，2004 . 4 . 24 ) 。該芯片包含了至 2004 年 5 月，所有這些種的 EST 和全長序列設計的探針。
GeneChip 探針芯片制造過程結合了光刻和化學合成技術。1.7cm2 的芯片上有幾萬到幾十萬個不同的寡核苷酸探針，每個探針點（探針室）20 mm。每一個目標轉錄組由一套長度 25 個堿基的 11 個 PM 和 11 個 MM 探針來檢測。這些 PM 和 MM 探針（探針對）位置彼此相鄰。基因表達水平可以用 Affymetrix 軟件通過 PM 和 MM 探針之間亮度差異來計算（見注22) ，或者只用 PM 探針的亮度計算（RMA 和 gcRMA 分析）。
3.11 小麥基因芯片表達分析
3.11.1 RNA 樣品準備
對于特定組織，RNA [ 總 RNA 或者提純的 poly ( RNA species ) ] 提取和純化可以采用已有的步驟（步驟與 3. 4節敘述的類似）。RNA 提取也有許多商業試劑盒可供選擇。例如，TRIZOL - Reagent (Invitrogen ，見注2 3 ) 被推薦為小麥旗葉的總 RNA 提取方法。當提取物含有大量的糖蛋白和多糖時，標準步驟中勻漿（TRIZOLRNA提取說明步驟1 ) 和 RNA 沉淀（TRIZOLRNA 提取說明步驟 3 ) 需要略作修改。勻漿這一步，勻漿產物需要增加一步離心（見注 24) 。RNA 沉淀這一步，水相回收沉淀總 RNA 需要用異丙醇和高鹽沉淀溶液（見注 25) 。為了得到高純度 RNA ( 特別是 A260/A230。比值 >1.8)，我們還建議 RNA 過 RNeasy 柱（Qiagen，見注26 ) 洗滌。RNA 清理建議放在總 RNA 樣品中去除基因組 DNA 之后進行（見 3.4 節）。核酸濃度和質量分別用 Nanodrop ND 1000 分光光度計和 Aglient 2100 生物分析儀（RNA 6000 Nano Assay, Agilent Technologies , Palo，Alto，CA , USA ) 檢測（見注 16)。
3.11.2 cDNA 合成和標記（見注 27 )
從總 RNA [ 或者純化的 poly ( A ) RNA ] 合成雙鏈 cDNA，然后生物素標記的 cRNA 由 cDNA 體外轉錄。與基因探針芯片雜交前，發現 cRNA 片段對于最高靈敏度是很關鍵的。
3.11.3 雜交（見注 28)
準備雜交混合物包括 cRNA 片段和探針芯片對照。與探針芯片雜交，孵育 16 h。
3.11.4 探針芯片洗脫與染色
( 1 ) 流體工作站（fluidic station ) 的設置： 流體工作站是用于芯片洗脫和染色的。它是通過兼容 PC 工作站上 GeneChip Operating System ( GCOS ) /Microarray Suite 操作的。步驟包括設置和啟動流體工作站（見注 29 和注 30)。
( 2 ) 芯片的洗滌和染色（見注 31 ) : 16 h 雜交后，除去芯片上雜交液（ 見注 28) ，然后將芯片完全浸入適當體積推薦的清洗液（見注 31)。
3.11.5 芯片掃描（見注 31)
一旦掃描結束，每張完整的芯片圖保存在一個以.dat 為擴展名、實驗名字命名的文件。GCOS 采集和分析芯片圖譜及實驗數據：定義探針單元并計算每個單元的光強度 ( 見注 22) 。由于制造過程中的更高的質量控制，許多 cDNA 芯片圖譜分析的問題，如空間變異對 Affymerix 芯片來說不用考慮（ 3.8 節）。產生了包含每一個 PM 和 MM 探針信號值的輸出文件（cel 文件）。
3.12 小麥基因芯片數據分析
Affymetrix 公司芯片廣泛用于許多種生物，人們投入了相當大的精力來開發和測試不同的方法分析信號，以尋找最好的基因表達檢測方法。Affymetrix 開發的方法是以一組探針的 PM 和 MM 之間的平均差異來估計表達（ MAS5 ) 。然而，MM 信號值的有效性還有疑問，而且有一些替代的方法看起來事實上超過了 MAS5。RMA (robustmultichipaverage) 算法取一個實驗的所有 PM 數據（如全部 cel 文件），不僅標準化每個芯片表達數據中位數，而且對每個芯片表達數據使用相同的方差 [17]。gcRNA 算法是 RMA 一個變種，它將每個探針的 GC 組成對信號貢獻的權重考慮在內[18]。與其他方法相比，在標樣 [ 19 ] 檢測和實時反轉錄 PCR 定量 [ 20 ] 方面，它能很好處理 Affymetrix 芯片數據。gcRNA 算法可以使用開源的 Bioconductor 軟件包（http :// w w w .bioconductor .org) 或者商業軟件如 GeneSpring7 (Agilent Technologies, Inc) 。
一旦選擇了表達檢測方法（如 MAS5、RMA 、gcRNA 或者其他），接下來的分析是一樣的，而非標準化數據（ 如 MAS5 ) 必須首先進行標準化（如除以每一個芯片表達值的中位數）。建議先篩選探針集，保留絕對表達值高于閾值（至少一個樣品如此）的所有探針（可以從芯片中非小麥對照的信號判斷）。這些探針進一步篩選那些表達差異在任何一對樣品的閾值之上的；通常 1.4 倍的變化被認為是可以檢測到的最小值。實質等同性實驗設計通常有 2 個以上基因型，至少 3 次生物學重復。為了檢測到基因型之間統計上顯著差異表達的基因，對每個探針集的表達值的對數（它們通常呈對數正態分布）作方差分析 （ANOVA ) 。假定即使經過篩選，探針數量依然非常大，可以用多重檢驗校正。Benjamini-Hochberg 假陽性率（ FDR ) 校正 [ 21 ] 是不錯的選擇。對許多探針做經典的 P＜0.05 的方差分析和 Benjamini-Hochberg 多重檢驗校正，能夠有大約 5% 的基因通過純屬偶然。然而，如果很少或根本沒有基因通過此校正，可以取消多重檢測，方差結果是假陽性率所致。例如，如果 1000 個探針 P <0.05 測驗，50 通過了但沒有多重檢驗校正，這只是不超過預計的運氣。重要基因名單的實質等同性標準是與 cDNA 芯片實驗相同的 [ 5 ] 。