1.硅膠微粒硅膠及鍵合硅膠是開發最早、研究深入、應用廣泛的HPLC固定相。未改性硅膠表面學性質隨制備和處理條件不同而変化。如圖2所示，水合硅膠的表面一般存在三種類型的硅羥基，熱處理溫度高于800℃時，硅膠表面的硅羥基（—SiOH）表層大部分不再存在，在HPLC中已無使用價值。用于進行鍵合反應制備改性硅膠HPLC固定相的硅膠表面需要選行完全羥基化，硅膠表面硅羥基最大濃度約為8 μmol/m2。游離硅羥基酸性很強，能與堿性溶質產生強相互作用，因此該類硅膠固定相往往使堿性化合物保留值增加、峰變寬、拖尾。完全羥基化的硅膠基質固定相氫化硅羥基濃度較高，有時可達總數的25％~30％。氫化硅羥基的酸性比游離硅羥基弱，有利于堿性化合物的色譜分離，表3為硅膠上官能團對不同結構化合物吸附能力強弱的比較。
圖2 HPLC硅膠坦體的表面結構硅膠基質的純度對許多極性化合物的分離極為重要，Fe、AI、Ni、Zn等金屬雜質能與某些溶質絡合，引起不對稱或拖尾峰，甚至溶質完全被固定相吸附，不能洗脫。硅膠晶格中的其他金屬（尤其是鋁）能使表面硅羥基活性增強，酸性增強。因此，許多HPLC分離，尤其是堿性與強極性化合物需用高純硅膠。表3列出了一些適用于堿性化合物分離的硅膠品牌。
表3 硅膠上官能團吸附強弱的分類
吸附強弱 | 官能團 |
無吸附弱吸附中等吸附強吸附 | 脂肪烴烯烴、硫醇、硫醚、單環和雙環芳烴及鹵代芳烴。稠環芳烴、醚、腈、硝基化合物和大多數羰基化合物醇、酚、酰胺、亞胺、酸 |
一般規律 | （1）氟化物<氯化物<溴化物<碘化物；（2）官能團之間的內氫鍵將使保留值減小；（3）極性基團附近有龐大烷基存在時，保留值減小；（4）順式幾何異構體比反式幾何異構體的保留值大；（5）環己烷衍生物和甾體的中體基團比軸端取代基有更強的保留性 |
2.多孔聚合物聚合物固定相在氨基酸、有機酸、多糖以及無機離子分離中應用較多。常用的反相HPLC聚合物基質固定相由二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯制成，取代異丁烯酸與聚乙烯醇基質固定相也已經商品化。由于大多數多孔聚合物在pH=1~13范圍內具有良好的穩定性，可以在高pH值條件下使強堿性溶質以自由態或非電離形態存在，改善色譜峰形，得到較好分離。有些堿性化合物可以采用替代離子對色譜法，用0.1moML的氫氧化鈉將強保留物質從柱中洗脫出來。采用C18、一NH2和一CN等功能團對多孔聚合物微粒表面進行改性能夠得到不同選擇性的正相或反相色譜固定相:采用一COOH、—SO3H、—NH2和一NR3+等改性多孔二乙烯基苯交聯的聚苯乙烯聚合物可以得到離子交換色譜固定相。
與硅膠基質離子交換劑相比，聚合物基質離子交換劑存在柱效低、分離慢的缺點，并且這種擔體在不同有機改性劑中的溶脹程度不同，填充床會因微粒溶脹不同而變化，在梯度洗脫中溶脹現象更加明顯。但由于其可以在寬pH值范圍下運行，已被廣泛用于生物樣品的分離、提純，如在高pH值下清除內毒素和其他生物污染物。
大多數聚合物基質的機械強度較差，通常不能在較高的壓力下使用。無機有機雜化基質通過在基質中構建硅骨架使其機械強度得到改善。同時，可以對其表面存在的不同位點進行不同的改性，制備多種分離機制復合的固定相，滿足特殊的分離需求。
3.石墨化碳固定相不經過特殊衍生處理的石墨化碳即可作為正相、反相、離子交換等不同分離模式的色譜固定相。不同于硅膠基質的烷基鍵合相，石墨化碳表面與溶質存在偶極作用，對極性化合物的保留一般比烷基鍵合硅膠或多孔聚合物強，因此可用于分離在C18鍵合相柱上保留較小的強親水性化合物。
石墨化碳固定相pH穩定性好，可以在低或高pH值條件下運行，也可以在高溫下運行，實現快速分離。目前商品化的 HYPERCARB固定相的比表面積約為120m2/g，平均孔徑25anm，平均粒度有5μm和7μm兩種規格，含碳量100％，耐壓超過40MPa（400bar）。
4.化學鍵合固定相化學鍵合固定相借助于化學反應的方法將有機分子以共價鍵連接在基質上制得，其優越性可概括為:①減弱基質表面活性位點，清除可能的催化活性；②耐溶劑沖洗，這是傳統液液分配色譜（LLC）逐新被鍵合相色譜取代的根本原因；③熱穩定性好；④表面改性靈活，便于工業規模制備鍵合固定相。
目前，高效液相色譜中80％以上的分析方法采用這種固定相，表4中列出了不同分離模式HPLC的常用固定相及其特點。
表4 HPLC中常用的固定相
固定相 | 特點 |
反相（與離子對）固定相 | 穩定性好，保留能力強，用途廣與C18相似，但保留能力降低 |
正相色譜固定相 | 穩定性好，極性適中，用途廣極性大于—CN |
尺寸排阻色譜固定相 | 耐用性好，作吸附劑用吸附性弱，溶劑兼容性好，適用于有機溶劑 |
離子交換色譜固定相 | 穩定性與重現性均不理想柱效不高，穩定，重現性好 |
①非鍵合相。除另有說明，均為硅膠基質鍵合相。
烷基與取代烷基改性硅膠固定相一般通過單官能團二甲基氯硅烷或三氯硅烷與表面硅羥基反應得到，圖3是分別采用兩種單體得到的十八烷基（ODS或C18）鍵合固定相的表面結構示意圖。二甲基氯硅烷單體的反應過程容易控制，得到的固定相的重現性好，由于溶質分子在較薄的固定相層內擴散，傳質過程迅速，柱效較高。采用三氯硅烷為單體制備鍵合相過程中羥基之間會發生二級反應，得到交聯型鍵合固定相。與非交聯型固定相比較，制備的重現性比較難于控制，柱效也相對較低。
5.整體柱整體柱（ monolithic column），又稱為連續床層固定相（ continuous- bed stationary phase）作為一種整體、連續的分離介質，整體柱通常采用原位聚合的方法在色譜柱空柱管內合成或采用類似澆鑄的方法制備成相應的形狀。硅膠基質整體柱的制備工藝與應用如圖4所示。
圖3 交聯型（a）和非交聯型（b）ODS固定相表面結構
圖4 硅膠基質整體柱的制備工藝與應用
整體柱基質主要有聚合物和硅膠基質兩種，聚合物基質的整體柱應用更多，主要有聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和聚甲基丙酸酯等類型，應用于多脈、低聚核苷酸、合成聚合物和小分子化合物的分離。
6.核殼型表面多孔層核殼型填料就是在堅實的硅膠核心上生成一個均勻的多孔外売。由于擁有核心硅球，多孔層厚度小、孔淺，樣品只需要花費少量的時間便能從硅球表面的孔中擴散出，在較短時間完成擴散和傳質。具有相對死體積小、出峰迅速、柱效高、滲透性好、機械強度高、裝柱容易等特點。梯度洗脫時，當流動相組成改變后，孔內外流動相可迅速達到平衡。也存在柱容量小、最大允許樣品量受限等缺陷。
