一.常用貯液與溶液 1mol/L亞精胺(Spermidine):溶解2.55g亞精胺于足量的水中,使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。 1mol/L精胺(Spermine):溶解3.48g精胺于足量的水中,使終體積為10ml。分裝成小份貯存于-20℃。 10mol/L乙酸胺(ammoniumacetate):將77.1g乙酸胺溶解于水中,加水定容至1L后,用0.22um孔徑的濾膜過濾除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA):加100mg的牛血清蛋白(組分V或分子生物學試劑級,無DNA酶)于9.5ml水中(為減少變性, 須將蛋白加入水中,而不是將水加入蛋白),蓋好蓋后,輕輕搖動,直至牛血清蛋白完全溶解為止。不要渦旋混合。加水定容到10ml,然后分裝成小份貯存于-20℃。 1mol/L二硫蘇糖醇(DTT):在二硫蘇糖醇5g的原裝瓶中加32.4ml水,分成小份貯存于-20℃。或轉移100mg的二硫蘇糖醇 至微量離心管,加0.65ml的水配制成1mol/L二硫蘇糖醇溶液。 8mol/L乙酸鉀(potassiumacetate):溶解78.5g乙酸鉀于足量的水中,加水定容到100ml。 1mol/L氯化鉀(KCl):溶解7.46g氯化鉀于足量的水中,加水定容到100ml。 3mol/L乙酸鈉(sodiumacetate):溶解40.8g的三水乙酸鈉于約90ml水中,用冰乙酸調溶液的pH至5.2,再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA:配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液(0.5mol/L),混合后形成EDTA的三鈉鹽。或稱取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH,并溶于水中,定容至1L。 1mol/LHEPES:將23.8gHEPES溶于約90ml的水中,用NaOH調pH(6.8-8.2),然后用水定容至100ml。 1mol/LHCl:加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。 25mg/mlIPGT:溶解250mg的IPGT(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)于10ml水中,分成小份貯存于-20℃。 1mol/LMgCl2:溶解20.3gMgCl2·6H2O于足量的水中,定容到100ml。 100mmol/LPMSF:溶解174mg的PMSF(苯甲基磺酰氟)于足量的異丙醇中,定容到10ml。分成小份并用鋁箔將裝液管包裹 或貯存于-20℃。 20mg/ml蛋白酶K(proteinase K):將200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中,輕輕搖動,直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml,然后分裝成小份貯存于-20℃。 10mg/mlRnase(無DNase)(DNase-freeRNase):溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中(pH 5.0)。溶解后于水浴中煮沸15min,使DNA酶失活。用1mol/L的Tris-HCl調pH至7.5,于-20℃貯存。(配制過程中要戴手套) 5mol/L氯化鈉(NaCl):溶解29.2g氯化鈉于足量的水中,定容至100ml。 10N氫氧化鈉(NaOH):溶解400g氫氧化鈉顆粒于約0.9L水的燒杯中(磁力攪拌器攪拌),氫氧化鈉完全溶解后用水定容至1L。 10%SDS(十二烷基硫酸鈉):稱取100gSDS慢慢轉移到約含0.9L的水的燒杯中,用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。用水定容至1L。 2mol/L山梨(糖)醇(Sorbitol):溶解36.4g山梨(糖)醇于足量水中使終體積為100ml。 100%三氯乙酸(TCA):在裝有500gTCA的試劑瓶中加入100ml水,用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解。(稀釋液應在臨用前配制) 2.5%X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷):溶解25mg的X-gal于1ml的二甲基甲酰胺(DMF),用鋁箔包裹裝液管,貯存于-20℃。 100×Denhardt試劑(Denhardt\'sregent) 依照上表稱取各組分,溶于水中定容。過濾除菌及雜質,分裝成小份于-20℃貯存。 10×標準DNA連接酶緩沖液(standardDNAligasebuffer)(粘端、平端連接) 將配制好的緩沖液分裝成小份,貯存于-20℃。 100mmol/LdNTP溶液(dNTPsolutions) 可以購買到100mmol/L純dNTPs貯液,-80℃可貯存至少6個月。 10mmol/LdNTP混合液 20%PEG8000/2.5MNaCl 加聚乙二醇于含有氯化鈉的燒杯中,加水至終體積100ml,用磁力攪拌器攪拌溶解。 20×SSC 溶解檸檬酸三鈉(二水)和氯化鈉于約0.9L水中,加幾滴10NNaOH溶液調pH為7.0,用水補足體積至1L。 DEPC(焦碳酸二乙酯)處理水 加100ulDEPC于100ml水中,使DEPC的體積分數為0.1%。在37℃溫浴至少12h,然后在15psi 條件下高壓滅菌20min,以使殘余的DEPC失活。DEPC會與胺起反應,不可用DEPC處理Tris緩沖液。 甲酰胺(deionizedformamide) 直接購買或加DowexXG8混合樹脂于裝有甲酰胺的玻璃燒杯中,用磁力攪拌器輕輕攪拌1h,可去除甲酰胺中的離子。經Whatman 1號濾紙過濾除去樹脂后分成小份,充氮氣于-80℃貯存(防止氧化)。 磷酸緩沖液(phosphatebuffer)
按照下表所給定的體積,混合1mol/L的磷酸二氫鈉(單堿)和1mol/L磷酸氫二鈉(雙堿)貯液,獲得所需pH的磷酸緩沖液。配制1mol/L
的磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)貯液:溶解138g于足量水中,使終體積為1L;1mol/L
磷酸氫二鈉(Na2HPO4)貯液:溶解142g于足量水中使終體積為1L。
TE(用于懸浮和貯存DNA)
Tris緩沖液(Tris-HClbuffer)
將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中,再根據所要求的pH(25℃下)加一定量的濃鹽酸(11.6N),用水調整終體積至1L。
二.電泳緩沖液、染料和凝膠加樣液
電泳緩沖液
50×Tris-乙酸(TAE)緩沖液
5×Tris-硼酸(TBE)緩沖液
染料
1%溴酚藍(bromophenolblue)
加1g水溶性鈉型溴酚藍于100ml水中,攪拌或渦旋混合直到完全溶解。
1%二甲苯青FF(xylenecyanoleFF)
溶解1g二甲苯青FF于足量水中,定容到100ml。
10mg/ml的溴化乙錠(ethidiumbromide)
小心稱取1g溴化乙錠,轉移到廣口瓶中,加100ml水,用磁力攪拌器攪拌直到完全溶解。用鋁箔包裹裝液管,于4℃貯存。
凝膠上樣液(gelloadingsolutions)
6×堿性凝膠上樣液(室溫貯存)
6×聚蔗糖凝膠上樣液(室溫貯存)
6×溴酚藍/二甲苯青/聚蔗糖凝膠上樣液(室溫貯存)
6×甘油凝膠上樣液(4℃貯存)
6×蔗糖凝膠上樣液(室溫貯存)
10×十二烷基硫酸鈉/甘油凝膠上樣液(室溫貯存)
三.常用培養基
LB培養基
將下列組分溶解在0.9L水中:
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