實驗技術：組織切片的制備

【目的】

組織標本必須首先被制成組織切片，再經過染色處理，然后才能在顯微鏡下進行臨床診斷和科學研究。

【原理】

蘇木素染色結合伊紅染色是常規組織學染色技術，也稱為H & E染色。蘇木素是堿性染色，細胞核被染成深紫或蘭色，常用作核染色；伊紅是酸性染色，細胞漿染呈紅色，常用作胞漿染色。

【材料】

1.試劑和溶液

（1）2-甲基丁醇(異戊醇)

（2）干冰

（3）O.C.T.(Tissue-Tek, SAKURA)

（4）冰凍或石蠟組織塊

（5）酸性Harris 蘇木素染料

（6）1％酸性酒精

70％酒精          99 ml

濃鹽酸             1 ml

（7）醇溶性伊紅染料

（8）酒精

（9）二甲苯

（10）樹脂封片液

2.設備

（1）塑料模具

（2）長鑷子

（3）Superfrost Plus玻片(Fisher Scientific)

（4）蓋玻片

（5）刀片(一次性或非 一次性)；

（6）冰凍或石蠟切片機(Leica , Micorm 或其它)

【方法】

方法1、冰凍切片的制備

一、準備冰凍組織

1. 用塑料或不銹鋼容器盛上2-甲基丁醇(異戊醇)，然后不時放入小塊干冰，使溫度降至-40oC到-50oC,并保持低溫。

2. 標記塑料模具并將O.C.T灌入模具，覆蓋其底部。

3. 收集組織標本。快速，輕柔和準確地取材以保證組織標本的質量，是獲得高質量免疫標記染色的最基本條件。

4. 將取下的組織標本置入灌有O.C.T 的模具，用O.C.T 灌滿模具，直至標本完全被其覆蓋。組織標本應盡量貼近模具底部，使標本在切片時易于暴露。酌情調整組織標本的位置。用長鑷子挾住模具，放入冷卻了的2-甲基丁醇(異戊醇)溶液中。為了避免產生空泡，先將模具底部觸及溶液，盛有標本的模具從底部開始向表面冷凍，然后將整個模具放入溶液中5-10分鐘。

（1）多數取下的組織標本可以直接放入模具。如標本沾有大量液體，應當用吸水性能好的紙沾去多余的液體，然后冷凍包埋。不要用溶液清洗標本。

（2）需要先固定處理的組織標本，可以在完成固定后，用10％到30％蔗糖-緩沖液處理，再冷凍包埋。

5. 將凍好的組織標本保存在-80oC 冰箱以待使用。

二、制作冰凍切片

1. 切片前先將冰凍組織標本從-80oC冰箱里取出，放在冰凍切片機(-20oC) 內復溫。

2. 用O.C.T.將冰凍組織塊凍在冰凍標本盤上，然后將其固定在切片機上。調整好組織塊平面與刀片的位置后，開始切片。直至切到預想的部位后，開始收集切片。根據研究目的的不同，切片可選擇不同的厚度。3-6 μm是常用的切片厚度，也可以是25-50 μm厚。

3.切片在室溫下晾干，然后用理想的固定液固定。如果選用冷丙酮或丙酮/甲醇，切片在經過20 分鐘固定，并在室溫下晾干后，可以直接用于染色，或者將其放在密封的切片盒并存入-80oC冰箱，以待使用。

4. 余下的冰凍組織塊，可用O.C.T.覆蓋其暴露面，然后存入-80oC冰箱以待下次使用。

方法2、石蠟切片的制備

1．收集組織標本并將其固定。10％福爾馬林緩沖液是最常用固定液，也可根據實驗的需要選用其它固定液。根據標本的大小，將其在室溫下固定8-24小時，或更長。標本的厚度以不超過3 mm 最佳。完成固定后，標本即可進行下一步的處理。

2．制作石蠟組織塊需要專用的設備，以及復雜的組織處理過程。通常由組織學或病理學實驗室完成。

3．石蠟切片。準備好盛有40oC蒸餾水的水浴箱，把包有組織的石蠟塊固定在石蠟切片機上，根據需要切成一定的厚度(常用4-6 μm)，將切片浮在水浴箱的水面上，再轉到Superfrost Plus片子上。切片在室溫下自然風干過夜，貯存待用。