密度梯度離心基礎知識（三）

●等運動梯度（等速梯度）（Isokinetic）
等運動梯度是指在某一恒定離心轉速時，樣品顆粒在梯度中以定常速度沉降。要做到等速沉降，必須使梯度液密度和粘性力的增加與沿著離心半徑方向的離心力增加相平衡，在這種梯度液中，顆粒的沉降距離與離心時間，離心力，以及顆粒本身的沉降系數成正比。因此如果已知某單一組份樣品的沉降系數，就可以算出在同一梯度中沉降的其他組份的沉降系數。
在甩平轉頭中用等速沉降梯度時，從旋轉中心算起的離心距離與沉降系數的關系應該是線性關系。為了構造等速沉降梯度我們必須注意到轉頭、離心管，梯度介質的密度、濃度和粘性系數在同一溫度。
在甩平轉頭中作蛋白質分離常用 5~20%（W/V）蔗糖梯度在 5℃離心可以達到近似的等速沉降的效果，而 10~30%（W/V）的甘油梯度在 5℃時 DNA或 RNA也可以達到近似等速沉降的目的，其他大多數樣品分離的等速沉降梯度是凸指數型曲線。
●凸型指數曲線與凹型指數曲線梯度：
為了支持樣品使其中組份在離心開始前不致于沉入梯度，我們常希望梯度曲線在近液面處有較陡的斜率，也就是說在近液面處梯度液的密度沿離心管長度方向增加得很快。這就是凸指數曲線梯度，與此相反，如果液面處梯度液足以支持（托住）樣品，故考慮到某些樣品在離心管中下部需要較慢的沉降率（在高密度區）才能得到理想的分辨率，那么凹型指數曲線型梯度便能滿足這個要求。
●復合型梯度：
如果用程序梯度儀來準備梯度，那么上節中的凸凹指數曲線梯度可以復合在同一梯度液中，這樣的復合梯度在它們各自的區域保持了它們各自的優點。當然也可以制備其他類型的復合梯度。一般說，復合梯度多用于區帶離心。

2、等密度離心，梯度要素的選擇
（1）梯度材料及梯度溶液選擇
所有的等密度離心都使用水溶性緩沖劑作溶劑，緩沖劑的組成及 PH值取決于生物樣品的性質。對細胞、亞細胞結構或其他生物大分子的等密度離心分離各有不同要求。
常用于等密度離心梯度材料有：

從上表可以看出，對 R-Z離心，蔗糖是很好的梯度材料，而對于等密度離心，不同的生物樣品對梯度材料的要求有較大差異。
（2）梯度型式選擇
離心時，溶液中的各組組份都同時處在離心場中，被分離的組份及梯度材料的分子都在離心力作用下向離心管底部（甩平、角式）或外壁（垂直管、近垂直管、區帶轉頭、連續流轉頭）沉降。對于梯度材料，如果它們的沉降速度在離心初始階段遠大于濃度擴散速度，那么就可以形成連續的密度梯度。這就是“自形成梯度”產生的基本原理。我們可以把被分離樣品和梯度材料混合在一起離心，梯度材料在離心過程中形成密度梯度，而樣品中不同組份則沉降（或上浮）到它們自己的等密度區。
另一種方法是預先制備好密度梯度，將樣品鋪在離心管（或區帶轉頭）的某一部份（如離心管上部、下部或中部）離心，使樣品中各種組份沉降（或上浮）到它們自己的等密度區前后，從而達到了我們所需要的“平衡”結果。
預先形成梯度可以是不連續的（階梯型），也可以是連續梯度。階梯型不連續梯度大多適用于從植物或動物組織的勻漿中分離整細胞或亞細胞器，或用于某些病毒的純化。而連續梯度由于其密度平滑地變化，對于某些生物樣品的多種成份組合的分離可以得到較高的分辨率因而得到了廣泛的應用。
選擇自形成梯度還是預形成梯度，主要取決于材料的性質。某些膠體硅材料可在10,000~20,000×g的離心場中離心30分鐘就可以自形成梯度（例如美國 Dupont公司的 Ludox及瑞典 pharmarcia公司的 Percoll）。但對某一些材料，自形成梯度的時間很長，對離心力的要求也很高。CSCL或 Metrizamide需要在50,000~500,000×g的離心場中離心數小時甚至數十小時才能自形成梯度（如用CSCL做質粒 DNA分離，梯度液中加 E.B.和 Triton x-100，在 490,000×g需要離心4小時，才能利用CSCL的自形成梯度分離出質粒DNA，染色體DNA，RNA和蛋白質。）
預形成梯度的主要優點是離心時間較短，因為我們只要考慮樣品中某個組份到達其等密。
預形成梯度的缺點是：
●被分離樣品的容量較少（與自形成梯度相比）
●對某些樣品如細胞或病毒會因單向沉降而產生顆粒聚結從而減少了樣品回手率甚至影響純度。
●預先制備梯度液需較長時間，亦較繁復。
與預形成梯度相比較，自形成梯度有較大樣品容積（特別是使用垂直剖面積較大的垂直管或近垂直離心這個優點更突出）；可以簡單地調整初始密度；離心過程中樣品既有上浮又有沉降，也就是混在梯度液中的樣品在離心過程中，在梯度材料自形成梯度的同時從離心力的正反二個方向向自己的等密度區靠攏，最后排列在自己的等密度區上下形成純樣品區帶。從這個意義上說，樣品是真正到達了自己的等密度取而具有很高的濃度。
自形成梯度的等密度離心又稱平衡等密度離心（Eguilibrium-Isopycnic）
（3）自形成梯度
綜上所述，某些梯度材料能夠在離心過程中形成密度梯度， Ludox，Percoll中的膠體硅顆粒可以較快地向離心管管底（如甩平轉頭等）或外側（垂直管轉頭）沉降而另一些材料如 CSCL，CS2SO4，Metrizamide等則在沉降過程中受到其反向濃度擴散的影響，達到平衡的時間就特別長。平衡后梯度曲線的形狀不僅依賴于梯度材料本身，也取決于其他一些離心條件。自形成梯度的最基本條件是樣品中需要分離的各種組份在分離后都就包含在梯度范圍中。最佳的自行梯度形狀還應該使被分離組份都處在各自的較窄的純樣品區帶內，只有這樣才能得到較高的分辨率。使很多單一組份在尺寸和密度上都有差異，這就使得同種樣品區帶離心后顯得比較寬。為了提高分辨率就必須使梯度曲線變得陡一些，但要隨心所欲做到這一點卻很困難。
幸運的是對于所有梯度材料，計算自形成梯度的公式（也就是自形成梯度曲線的形成原理）是一樣的。由于 CSCL分離質粒DNA已有近 30年的歷史，大多數定量分析工作集中于討論CSCL梯度。用下面的一些公式可以計算自形成梯度曲線的形狀，可用于設計最合適的密度梯度。
●梯度曲線的斜率：
密度梯度曲線中某一點的昀終斜率可以用dρ/dr下式計算：

其中：ω是弧度（弧度/秒）
         r：從旋轉中心到計算點的距離（cm）
         β°：梯度材料的密度梯度比例常數。
β°的數值請參考：
（1）余興明“質粒 DNA的超速離心分離”或
（2）J.B.Martin “Biopolymers”9，1970，P597

用這個公式計算梯度曲線的中下部占3/4離心管中梯度高度的dρ/dr值比較接近實際情況，對
上部1/4長度與實際情況有些差別。