寡核苷酸介導的誘變實驗

大腸桿菌

PEG TE ATP 寡核苷酸誘變引物 T4多核苷酸激酶 EDTA SSC

水浴鍋 電泳儀 培養箱

1.  將一個單鏈噬菌體產生的噬斑轉移至含有1 ml 滅菌TY培養基的1.5 ml 微量離心管中，60℃溫育5 min，以殺滅細菌細胞，劇烈振蕩以釋放瓊脂中的噬菌體，離心2 min。

2.  將100 μl 上清轉移至1 L 的燒瓶，瓶中裝有100 ml 培養基，其中含0.25 μg/ml 的尿苷。

3.  加5 ml 處于對數生長中期的大腸桿菌培養液，于37℃劇烈 振搖培養6~18 h。

4.  以5 000 g 離心30 min，保留上清。

5.  確定噬菌體在ung^-大腸桿菌對ung⁺大腸桿菌中的相對滴度。
 

4.  毎4體枳的上清加1體積的5×PEG/NaCl溶液以沉淀噬菌體，混勻，0℃溫育1 h。

6.  5 000 g 離心15 min，倒棄上清，在15 ml Corex管內用5 ml TE緩沖液溶解沉淀，在旋渦混合器上劇烈振蕩。

7.  將噬菌體溶液置冰上1 h，如上步再次離心以去除細胞碎片，再用酚抽提和乙醇沉淀單鏈噬菌體DNA，通過測260 nm 吸光值確定DNA濃度。

8.  在1.5 ml 微量離心管內加入下列試劑：

（1）20 μl  10×T4多核苷酸激酶緩沖液

（2）2 μl  10 mmol/l ATP

（3）突變的寡核苷酸（長15~20個核苷酸〉

（4）加水至20 μl

（5）2 U  T4多核苷酸激酶

（6）37℃溫育60 min，加3 μl 100 mmol/l EDTA并加熱至70℃終止反應。

9.  加含尿嘧啶的單鏈環狀DNA模扳（通常為1 μg DNA溶解在1 μl 體積）至磷酸化的寡核苷酸中，加1.25 μl 20×SSC，充分混勻，離心5 s。

10.  將離心管放入一個盛有70 ℃水的500 ml 燒杯中，自然冷卻至室溫后離心5 s，置于冰上。

11.  加入下列試劑以形成雜交混合液：

（1）20 μl  5×聚合酶混合物

（2）2.5 U或T4 DNA聚合酶

（3）2 U T4 DNA連接酶

（4）加水至100 μl

（5）充分混勻，然后置于0℃5 min，室溫5 min，37℃2 h。

（6）最后加3 μl 500 mmol/l EDTA終止反應。

12.  取20 μl  在0.8%的瓊脂糖上電泳。對照泳道應包括單鏈環狀病毒DNA，雙鏈閉環DNA和帶切口的雙鏈壞狀DNA。

13.  根據電泳結 果估算DNA的量，用1~100 ng的雙鏈DNA產物轉化ung⁺大腸桿菌。

14.  選擇性地或隨機挑取所得克隆（噬斑或菌落）用以分離純的克隆原種。

15.  通過DNA序列測定對選出的克隆進行分析。