將DNA導入酵母細胞實驗_乙酸鋰轉化

待轉化的酵母菌株

YPD培養基YPAD培養基：添加30 mg L腺嘌呤半硫酸的YPD培養基高純無菌水l0×TE緩沖液pH 7.5無菌10×乙酸鋰儲液：1 mol L乙酸鋰pH 7.5 (用稀乙酸調pH)過濾除菌DNA ：高分子質量單鏈載體DNA和待轉化DNA50% (m V) PEG 4000 或 PEG 3350 (不能用 PEG 8000)過濾除菌CM缺失成分培養基平板用Difco瓊脂制備

恒溫搖床、水浴鍋

1)在開始實驗前2天，接種待轉化的酵母菌株的單菌落于5 mL YPD培養基中，于 30℃恒溫搖床，培養過夜達到飽和。

2)轉化的前一天晚上，往1 L無菌燒瓶中加入300 mL YPAD培養基，然后接種適量的 飽和培養液，再于30℃培養過夜，到細胞密度為1×l0⁷細胞/mL OD₆₀₀=0.3?0.5，依據菌株而定）。為了獲得2?3倍高的轉化效率，此時用新鮮的YPAD培養 液稀釋使細胞密度為2×10⁶細胞/mL，然后培養生長1?2代（2?4 h)。

因為生長期和細胞密度對獲得最佳的轉化效率是十分重要的，因此最簡單的方式就是在3個不同 的燒瓶中分別接種不同體積的飽和培養液，例如，在12 h的生長期可嘗試加入1μL、5μL和25μL過夜培養液，然后在第2天檢查每個燒瓶中培養液的OD₆₀₀值。

3)培養液在室溫條件下4000 g離心5 min，收集細胞。細胞用10 mL無菌超純水重懸，然后轉移到一個更小一些的離心管中，再于室溫下5000?6000 g離心5 min,沉淀細胞。

4)細胞用1.5 mL鋰鹽溶液重懸，鋰鹽溶液按下列方法配制，現配現用：

1體積10×TE緩沖液，pH 7. 5

1體積10×乙酸鋰儲液 8體積無菌超純水

5)每次轉化時，200 載體DNA和<5 轉化DNA —起加入1. 5 mL微量離心管中混勻，DNA的總體積<20μL。

要獲得最佳的轉化效率，轉化之前要重復對載體DNA進行變性循環處理（沸水浴和冰浴）。

6)往每個離心管加入200μL用鋰鹽溶液重懸的細胞懸液，再加入1. 2 mL新鮮配制的PEG溶液。PEG溶液配方為：

8 體積 50% PEG

1體積10×TE緩沖液，pH 7.5

1體積10×乙酸鋰儲液 30℃搖蕩溫育30 min。

7)于42℃熱激15 min,室溫下離心5 s,細胞沉淀用200μL ?1 mL 1×TE緩沖液（從 10×儲液新鮮配制）重懸，并取其中200μL涂布在Difco瓊脂制備的CM缺失成分培養平板上。30℃培養2?5天，直到出現轉化子。

注意：所有溶液和與酵母細胞接觸的玻璃器皿必須是無菌的。在玻璃器皿上任何痕量的去污劑都 可降低轉化的效率。另外，用于配液和清洗玻璃器皿的水必須具有很高的純度。

最常用的酵母菌轉化方案，不僅快捷，而且轉化效率高。