小分子RNA

RNA一度被認為僅僅是DNA和蛋白質之間的“過渡”，但越來越多的證據清楚的表明，RNA在生命的進程中扮演的角色遠比我們早前設想的更為重要。RNA 干擾（RNA interference）的發現使得人們對RNA調控基因表達的功能有了全新的認識，更因為可以簡化/替代基因敲除而成為研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science評選的10大科學成就中RNAi名列榜首。隨著對小分子RNA研究的不斷深入，研究人員開始認識到：小分子 RNA的世界一點都不小。有人推測：小分子RNA可能代表發現了一個新層次上的基因表達調控方式。生物通早在去年底到今年初已經有很多文章介紹有關 siRNAs以及其在RNA干擾中的作用以及研究應用方法，在這里生物通繼續為我們的用戶介紹另一種越來越引人注目的小分子RNA——microRNA。
什么是miRNA
MicroRNAs （miRNAs）是一種大小約21—23個堿基的單鏈，是由具有發夾結構的約70-90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關。據推測，這些非編碼（miRNAs）參與調控基因表達，但其機制區別于siRNA介導的mRNA降解。*個被確認的miRNA是在線蟲中首次發現的lin-4 和let-7，隨后多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數百個miRNAs。

miRNA 的特征
已經被鑒定的miRNAs據推測大都是由具有發夾結構、約70個堿基大小形成發夾結構的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和 3’羥基，大小約21—25nt的  片斷，定位于RNA前體的3’端或者5’端。
zui近3個研究小組分別從線蟲、果蠅和Hela細胞中鑒定的100個新miRNAs中，有15%跨越線蟲、果蠅和哺乳動物基因組具有高度的保守性（只有有1—2個堿基的區別），Lau 和Bar 實驗室的同事更加認為：所有的miRNAs可能在其他物種中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物體中行使同一功能的基因群就可比作為一個門類，這些類似的基因被稱為“直向同源物”）。
Bantam zui早被認為是果蠅中參與細胞增殖的一個基因位點。已知幾個包含增強子的轉座子插入跨越這個位點的一段12.3kb區域會導致果蠅的眼和翅重復生長，而由轉座子介導的一段跨越該位點的23kb片斷缺失則導致突變果蠅個體小于野生型果蠅。Cohen和同事用一段3.85kb的片斷導入21kb片斷缺失的果蠅中使其恢復原來的大小。但是奇怪的是表達這個3.85kb片斷中的EST卻沒有同樣的效果。Cohen將這個片斷和瘧蚊Anopheles gambiae的同源序列進行比較，發現一段90bp的高度保守區，經過RNA folding program （mfold）發現這個保守序列可以形成發夾結構，使得這個區段很象是一個miRNA的前體。這個結果經過Northern blot證實突變果蠅的幼體缺少一個21bp的bantam miRNA ，用這個90bp的mRNA前體經過一系列的“功能缺失”—“功能恢復”實驗，證實 bantam miRNA在細胞增殖中的作用。研究人員用計算機程序檢索在hid mRNA的3’非編碼區找到了bantam的3個潛在的結合位點（ hid是果蠅中一個誘導凋亡的基因），并證實 bantam miRNA抑制hid 的翻譯而非轉錄。
miRNAs的表達方式各不相同。部分線蟲和果蠅的miRNA在各個發育階段的全部細胞中都有表達，而其他的miRNA則依據某種更為嚴謹的位相和時相的表達模式（a more restricted spatial and temporal expression pattern）——在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異。

miRNA的功能
對microRNAs （miRNAs）的研究正在不斷增加，原因是科學家開始認識到這些普遍存在的小分子在真核基因表達調控中有著廣泛的作用。在線蟲，果蠅，小鼠和人等物種中已經發現的數百個miRNAs中的多數具有和其他參與調控基因表達的分子一樣的特征——在不同組織、不同發育階段中miRNA的水平有顯著差異，這種 miRNAs表達模式具有分化的位相性和時序性（ differential spatial and temporal expression patterns），提示miRNAs有可能作為參與調控基因表達的分子，因而具有重要意義。
*個被確認的miRNA——在線蟲中首次發現的lin-4 和let-7，可以通過部分互補結合到目的mRNA靶的3’非編碼區（3’UTRs），以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，通過調控一組關鍵mRNAs的翻譯從而調控線蟲發育進程（reviewed in Pasquinelli 2002）。
bantam miRNA是*個被發現有原癌基因作用的miRNA。除了lin-4、let-7，已知還有一些miRNAs可能參與在細胞分化和組織發育過程中起重要作用的基因的轉錄后調控，例如mir-14、mir-23 等。
在植物miRNAs的研究中有兩條線索提示miRNAs可能參與植物的發育過程。一是在carpel factory （car） 突變株中3個miRNAs的表達水平顯著下降。CARPEL FACTORY 是一個類似Dicer的酶，參與植物的發育，其缺失突變株表現為胚胎和葉片發育的缺陷。實驗結果提示這種缺陷是由于缺少miRNAs加工而造成的。多數的植物miRNAs在某些特定組織中高水平表達也提示他們可能參與了植物組織的發育。
對一部分miRNAs的研究分析提示：miRNAs參與生命過程中一系列的重要進程，包括早期發育（Reinhart 2000），細胞增殖，細胞凋亡，細胞死亡（Brennecke 2003），脂肪代謝（Xu 2003）和細胞分化（Kawasaki 2003）。此外，一個研究表明，2個miRNAs水平的下降和慢性淋巴細胞白血病之間的顯著相關，提示miRNAs和癌癥之間可能有潛在的關系 （Calin 2002）。
由于miRNAs存在的廣泛性和多樣性，提示miRNAs可能有非常廣泛多樣的生物功能。盡管對miRNA的研究還處于初級階段，據推測miRNAs在高級真核生物體內對基因表達的調控作用可能和轉錄因子一樣重要。有一種看法是：miRNAs可能代表在一個新發現的層次上的基因表達調控方式。
然而，大多數miRNAs的功能仍然是個謎。

miRNA的作用方式
zui早被發現的兩個miRNAs——lin-4 and let-7被認為是通過不完全互補結合到目標靶mRNA 3’非編碼區端，以一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制，進而抑制蛋白質合成，阻斷mRNA的翻譯。多個果蠅miRNAs也被發現和他們的目標靶mRNAs的 3’非編碼區有部分同源。由于miRNAs和其潛在的目標靶之間并非完全互補，這使得通過信息學的方法鑒定miRNA的目標靶位點變得困難。因而也無法確定miRNAs的作用方式是什么，以何種機制影響mRNA的翻譯，以何種方式調控基因表達。miRNAs的作用目標靶和活性機制一直是各地的研究人員的關注熱點。
在植物中目前有一個miRNA和3個潛在的目標靶基因完全互補（這些scarecrow 基因編碼潛在的轉錄因子），盡管目前還不清楚這些基因是否就是miRNA的目標靶，這仍是*次發現miRNA 和其潛在的目標靶完全互補，也提示miRNA可能包含和siRNA類似的作用方式。

識別 miRNAs的方法
多個研究小組采用生物化學結合是生物信息學的方法開展對miRNAs的研究工作。由于據推測都是由Dicer酶降解RNA得到的，21—23個堿基大小、有5’端磷酸基和3’羥基的RNA    片斷，有的實驗室采用改良的定向克隆方法來篩選具有相同特征的小分子——篩選一定大小的RNA分子，連接到3’和5’的適配子（adapters），逆轉錄并通過PCR擴增、亞克隆并測序。miRNA前體在基因組上的定位和聚類是通過向基因組數據庫查詢進行。這個方法有助于判斷miRNAs是否是mRNAs、tRNAs、rRNAs等分子的降解產物。
有的實驗室通過一種RNA folding program ’mfold’ 來判斷C. elegans 和C. briggsae 之間的高度保守區域是否含有潛在的miRNA前體，然后用Northern Blots的方法來確定這些miRNAs是否真的表達了。
盡管有數百個miRNAs通過生化或者是生物信息學的方法被鑒別出來，已經鑒別出來的miRNAs只不過是滄海一粟，由于很多已經鑒別出來的miRNAs是從單個克隆中鑒別出來的，所以可以假設還有很多miRNAs在分離和鑒定過程中被“漏掉”了，測序工作還遠遠不夠。

miRNA和siRNA的關系
miRNA和siRNA之間的關系令人迷惑。從表面上說，一個是非編碼的單鏈，在進化上高度保守，通過翻譯抑制調控基因表達而不影響轉錄本的穩定性；另一個是針對編碼區的雙鏈，每個轉錄本都可能有很多個siRNAs，是通過降解目標靶，在轉錄后調控基因表達。由于每個mRNA模版可能產生很多個siRNAs，要給每個siRNA定一個基因的名字就很困難。miRNA是進化進程中高度保守的，因此給直向同源物一個同樣的名字可能有助于了解他們的功能，而給另一個物種中一段無關的序列一個同樣的名字就容易造成混亂。
然而，據推測miRNAs通常是由較大的（70-90 nt）的莖環結構（發夾結構）前體經Dicer酶切割得到的，而Dicer同樣負責將長雙鏈RNA切割為siRNA，而且二者的長度也差不多，同樣有調控基因表達功能。因而這兩類之間的關系格外令人關注。
兩個廣為人知的miRNA——在線蟲中首次發現的lin-4 和let-7，可以通過部分互補結合到目的mRNA靶的3’非編碼區（3’UTRs），通過一種未知方式誘發蛋白質翻譯抑制從而抑制蛋白質合成。這種結合并不誘導mRNA靶的降解，就是說作為翻譯抑制子本身不影響對應mRNA的豐度，其原因據推測是由于miRNA和結合位點之間不完全互補。這就區別于 siRNA的介導的mRNA的降解。但是其他一些miRNAs可能以類似siRNA的方式介導目的RNA的降解。實驗表明引入和let-7目的mRNA靶完全互補的miRNA會誘導mRNA靶的降解。還有實驗結果表明一些miRNA，包括在植物中發現的Scarecrow miRNA，能結合完全互補的mRNA鏈從而降解mRNA序列，抑制蛋白合成。這提示miRNAs可以和siRNAs一樣作用，這兩種作用通路可能有重疊的部分。這種重疊同樣提示siRNAs可能也有和miRNAs同樣的功能。
一個很有趣的實驗證實這個觀點：Doench和同事挑選一個已知在體內可以有效使CXCR4基因沉默的siRNA，然后在熒光素酶報告基因的3’端插入對應的CXCR4結合位點——其中一個拷貝是插入一個完全匹配的CXCR4結合位點，另一個拷貝插入4個只有3’和5’端匹配，而中間不同的CXCR4結合位點，這樣選定的siRNA就不能完全結合到這個結合位點——中間形成一個突起的不匹配的環。將這兩個拷貝轉入Hela細胞并用siRNA誘導基因沉默。結果很有趣——兩個實驗都錄得熒光素酶活性下降了超過10倍，RT-PCR和Northern分析證實，*個實驗的熒光素酶轉錄本下降了超過10倍，這正是正常的siRNA介導的RNAi反應，目標靶mRNA降解導致表達水平的下降，而第二個實驗中熒光素酶轉錄本僅僅下降1.2倍，這種目的基因表達水平下看起來象源于miRNA介導的翻譯抑制降，而不是siRNA介導的影響mRNA的穩定性導致。實驗表明：siRNA可能以miRNA的方式作用于 mRNA。實驗人員還進行了另一個實驗：改變第二個實驗中的不匹配環的堿基序列看起來不影響抑制效果，但是siRNA和報告基因上的結合位點的匹配程度越高抑制效果越好，增加siRNA的量，抑制效果越好——這一點和siRNA抑制的情況一樣——*不同的是：完全匹配的結合位點（siRNA作用方式）可以單獨起作用而相互不影響，而增加不完全配對的結合位點（注意在第二個實驗中用了4個CXCR4結合位點）的個數對翻譯抑制有顯著的加乘作用。
在哺乳動物細胞中還沒有找到內源的siRNA，外源的siRNA介導的RNAi作用正是一種抵御機制。而miRNAs則廣泛存在于哺乳動物細胞中，從理論上推測可能參與多種調控作用。這兩種小東西的作用機制和相互關系的本質就顯得更加撲朔迷離。如何在實驗中正確鑒定siRNA和miRNA，甚至是其他的都成為一個值得關注的問題。
 

miRNAs在多個物種中廣泛被發現，而且在進化上高度保守。這些“小玩意兒”留給我們一大堆謎團：miRNA的確切功能是什么？它的目標靶是什么？作用機制是什么？也許需要對植物或者線蟲的基因組進行miRNAs突變株的篩選，在果蠅中可以用targeted-disruption缺失miRNA序列。對miRNA突變株伴隨的表型缺失進行研究，有助于解釋miRNAs的功能。
正如Phillip Zamore說的：“如果miRNAs在進化的進程中如此高度保守而沒有任何實際功能，那真是大自然拿科研人員開涮——而且是一個殘酷的玩笑”。
研究miRNA的新工具
隨著日益收受到研究人員的重視，很多研究的新方法不斷推出。

的分離
由于可能參與分化、發育、組織生長、脂肪代謝等生理過程，在不同的組織和發育階段的表達水平有所不同，進一步了解的生物功能需要確定其在各種生物樣品中的表達水平，因而需要一種精確的定量純化方法，從而得到可信的數據。
現行的RNA純化方法包括有機溶劑抽提+乙醇沉淀，或者是采用更加方便快捷的硅膠膜離心柱的方法來純化RNA。由于硅膠膜離心柱通常只富集較大分子的 RNA（200nt以上），往往被淘汰掉，因而不適用于的分離純化。有機溶劑抽提能夠較好的保留，但是后繼的沉淀步驟比較費時費力。mirVana miRNA Isolation Kit是采用玻璃纖維濾膜離心柱（glass fiber filter，GFF），既能夠有效富集10mer以上的RNA分子，又能夠兼備離心柱快速離心純化的優點，是一個不錯的選擇。對于特別稀有的分子，由于需要分離大量RNA而導致高背景而降低靈敏度，還可以進一步富集10mer到200bp的來提高靈敏度。

探針的制備 
方法其實很簡單：只需要準備目的基因的一小段寡核苷酸序列，3’端另外增加8個和T7啟動子互補的堿基，將這段寡核苷酸和T7啟動子引物退火，用 Klenow大片斷補齊得到雙鏈的轉錄模版，然后用T7 RNA聚合酶、rNTP和標記物混合，體外轉錄得到標記的探針。這種方法可以快速制備各種標記（同位素、非放射性標記均可）的小于100nt 的探針，適用于包括RPAs，Northerns 和原位雜交等各種方法檢測小分子核仁RNA（ small nuclear RNA,snRNA），small interfering RNA （siRNA）,，micro RNA （miRNA）和 mRNA。非放射性標記的探針還可以用于原位雜交研究miRNA或者mRNA在組織中的分布。

的檢測
由于是一類很小的分子，部分表達水平可能很低，因而需要極為靈敏而定量的分析工具。由于其分子很小，用RT-PCR的方法來定量研究非常困難，目前多數研究人員采用Northern Blots——一種技術復雜而費力的方法來檢測的存在。傳統的Northern Blot的方法是是用探針檢測固相支持物（膜）上的目標分子，由于用探針檢測液相中的目標分子遠比檢測固相中的目標更為靈敏，生物通在這里為大家推薦一種基于核酶保護分析方法改進的新方法——將同位素標記好的探針和待檢測樣品混合雜交，未雜交的RNA和多余的探針用單鏈核酸酶消化，然后使核酸酶失活，并純化雜交的RNA分子，zui后通過變性膠電泳放射自顯影檢測結果。這個基于液相雜交的新方法不但操作簡單而快速，而且靈敏度極高——可以半定量檢測少至10ng總RNA模版中的，或者說，可以檢測attomole （10-18 mol）級別的靶目標！靈敏度是Northern Blot的100倍。除此之外，研究人員還可以在同一個樣品中同時檢測多個和長的RNA模版。應該說，這個靈活巧妙的設計可以為從事小分子 RNA實驗的研究人員帶來不少方便。

總而言之，無論是siRNA, miRNA, snRNA還是其他的小東西，研究的不斷深入將幫助我們揭示更多生命的奧秘。