RNA甲基化（RNA methylation）是一類表觀遺傳修飾，在已經發現的超過100種不同的RNA化學修飾中，主要有6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）、5-甲基胞嘧啶（C5-methylcytidine, m5C）和1-甲基腺嘌呤（N1-methyladenosine, m1A）。RNA甲基化在調控基因表達、編輯、穩定性及降解等方面扮演重要角色。早在20世紀70年代，人們已經在真核生物的mRNA和lncRNA中發現了m6A修飾。但受制于技術的局限性，無法開展m6A檢測尤其是m6A定量分析，甚至是單堿基水平m6A的鑒定。隨著高通量測序技術（NGS）的發展以及液相色譜靈敏度的提高，RNA甲基化整體水平的鑒定方法得到了長足的發展。
目前RNA甲基化整體水平的鑒定所用的技術手段包括液相色譜聯用（LC-MS）、比色法以及Dot blotting等。下面就分別來介紹目前較為流行的RNA甲基化整體水平的鑒定方法。
圖1. RNA甲基化的主要類型
1. LC-MS/MS
LC-MS/MS在液相質譜的基礎上采用串聯質譜，能夠獲得分子離子峰和碎片離子峰，可對堿基同時進行定性和定量分析。第一步使用TRIzol提取完Total RNA后，對mRNA進行富集并去除rRNA。第二步是在37℃條件下，將200-300 ng mRNA用含有25 mM NaCl和2.5 mM ZnCl2緩沖液的核酸酶P1（2 U）消化2 h，然后加入NH4HCO3（1 M，3 μl）和堿性磷酸酶（0.5 U），37℃再孵育2 h后，將RNA從單鏈消化成單個堿基。第三步將樣品稀釋至50 μl并過濾，并將5 μl溶液注入LC-MS/MS中，根據出峰的保留時間面積計算各個堿基的含量。第四步進入質譜串聯分析，單個核糖核苷酸會被離子化，同時被打斷成五碳糖和嘧啶或嘌呤，在C18柱上通過反相超高效液相色譜分離核苷，使用Agilent 6410 QQQ三重四極桿LC質譜儀以正電噴霧電離模式進行質譜檢測，根據出峰的保留時間計算m6A的面積。最后根據m6A和總A的比例就能算出m6A在mRNA上整體的甲基化程度。
圖2. LC-MS/MS檢測RNA甲基化水平示意圖
2.比色法
比色法RNA甲基化整體水平鑒定也是我們云序生物的一款產品。相對于LC-MS/MS較為繁瑣的操作，比色法更為簡便。m6A定量檢測試劑盒（比色法）提供了所有定量檢測總RNA中m6A試劑。在這個分析試劑盒中，采用類似于ELISA抑制競爭免疫的方法，樣本和m6A標準品首次與m6A抗體溶液被孵育；然后轉移到包被有m6A多核苷酸的條孔上。在孵育之后孔可以洗脫任何未包被的試劑然后添加檢測抗體生成信號，通過微孔板讀取儀（如：酶標儀）來檢測。因為在樣本的m6A抑制了m6A抗體與涂抹在孔上m6A的結合，樣本中更高濃度導致與在孔中的m6A結合減少。因此，從孔總測的信號或OD參數與樣本中m6A的數量成反比。并且樣本中m6A的量可以通過預先設定的m6A標準品來實現定量檢測。
圖3. 比色法定量檢測m6A甲基化的操作步驟
3. 熒光法
m6A RNA甲基化定量檢測試劑盒（熒光法）提供了所有定量檢測總RNA中m6A的必要試劑。在這個分析試劑盒中，使用高效RNA結合液將總RNA綁定在孔板上。使用捕獲和檢測抗體對m6A進行檢測。隨著信號的增強然后使用熒光分光光度計讀取RFU（relative fluorescence units）吸光值。m6A的量與測量的熒光單位成比例。
圖4.熒光法定量檢測m6A RNA甲基化的步驟
4.Dot blotting
與其他方法相比，如二維薄層色譜和LC-MS/MS等，使用Dot blotting檢測mRNA中m6A甲基化總體水平的方法相對簡單、快速且成本較低。第一步是總RNA的提取，使用Dynabeads? mRNA Purification Kit分離出mRNA，采用NanoDrop方法檢測mRNA的純度，并稀釋成不同的濃度。第二步Dot blotting，在95℃的高溫下將連續稀釋的mRNA變性。在變性后立即冷卻，以防止mRNA的二級結構的重新形成。將2 μl的mRNA直接轉移至經核酸優化的尼龍薄膜上。在特定條件下進行自動交聯，采用溫和的方式洗去未結合的mRNA并過濾。在4℃、溫和震蕩的條件下，用抗m6A的抗體10 ml稀釋緩沖液孵育薄膜。在溫和震蕩的條件下，用10 ml的洗滌緩沖液對薄膜清洗3次，每次5 min。用羊抗兔IgG-HRP（1:10000稀釋，20 ng/ml）在室溫下孵育尼龍薄膜。用10 ml的洗滌緩沖液洗滌薄膜，每10 min清洗一次，每次清洗10min。在黑暗室溫下，使用3 ml的Western Blotting Substrate孵育尼龍薄膜。封膜處理后，用超薄膜ECL進行曝光，以獲得適當的曝光時間，最后顯影觀察。
圖5. Dot blotting操作步驟示意圖
RNA甲基化整體水平的鑒定今天就講完啦，大家記得收藏學習哦~
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