小鼠心臟組織蛋白樣品的蛋白質組學分析

實驗概要

本實驗提供了一個心臟組織2-DE蛋白樣品制備及檢測的流程，為蛋白質雙向電泳實驗做好準備。

實驗步驟

1. 心臟組織2-DE蛋白樣品的制備

    1) 將冷凍的小鼠心臟組織在液氮條件下研磨成粉末；

    2) 然后加入5 x體積蛋白裂解液(7 M Urea, 2 M Thiourea, 40 mM Tris, 4 % CHAPS, 65mMDTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 5 mM protease inhibitor cocktail, 0.5% Pharmaltes, pH3-10)，用Teflon勻漿器勻漿組織1 min，超聲勻漿30s；

    3) 室溫放置10 min，4^oC；

    4) 14,000 g離心30 min，收集上清，-80^oC儲存備用。蛋白質裂解液保存在-20^oC冰箱里備用。

2. 蛋白質含量測定

按Amersham 2-D Quant Kit操作說明進行:

    1) 取3ul蛋白樣品進行定量，每管樣品加入500ul沉淀劑(precipitant)，漩渦振蕩，室溫下放置2-3 min；

    2) 加入500 ul共沉淀劑(co-precipitant)，混勻；

    3) 4℃，10,000 g離心5 min；

    4) 棄上清，盡量沒有可見液體殘余，加入100ul銅溶液(copper solution)，和400ul去離子水，漩渦振蕩使蛋白沉淀溶解；

    5) 加入1 ml顯色工作液(working color reagent, color reagent A :color reagent B=100:1)，快速混勻，室溫下放置15^'20 min; 490 nm處測定吸收峰；

    6) 所得結果根據標準曲線計算樣品蛋白含量。