實驗概要
小鼠成纖維細胞向神經干細胞的定向轉分化
主要試劑
無菌水、DPBS、0.1%明膠、NSC M、0.05%胰蛋白酶胰蛋白酶、0.1 g/mL明膠、細胞基礎培養基、PDL、神經干細胞培養液、Polybrene、PDL、laminin
主要設備
35 mm培養皿、四孔板(UNIC)、移液槍、口吸管、玻璃管
實驗材料
小鼠成纖維細胞
攜帶有目的基因的逆轉錄病毒（滴度大于108）：pMX-cMYC、pMX-KLF4。這些質粒來源于addgene公司，質粒的詳細信息可從公司網站獲得。質粒擴增和提取的具體原理和步驟可見《分子克隆實驗指南》。pQCX-S0X2、pQCX-PAX6、pQCX-NGN2、pQCX-ID1、pQCX-ASCL1、pQCX-BRN2、pQCX-HES1。這些質粒來源于clonetech公司，質粒的詳細信息可從公司網站獲得。質粒擴增和提取的具體原理和步驟可見《分子克隆實驗指南》。使用前于-80℃保存。
實驗步驟
（1）在35 mm培養皿中加入1mL0.1g/mL的明膠，37℃、5%CO2培養箱中靜置1h。
（2）棄去1h前包被皿的明膠，將小鼠成纖維細胞以0.05%胰蛋白酶胰蛋白酶消化3 min，以等體積的成纖維細胞培養液終止，室溫200g離心5min，用成纖維細胞培養液重懸，按2×105每35 mm培養皿的密度接種于棄去明膠的皿中。
（3）接種后24 h，于成纖維細胞培養液中按終濃度4~8μg/mL加入polybrene，并在每2.5mL液體中加入9種病毒各10μL，充分混勻。
（4）棄去成纖維細胞培養皿中的培養液，每皿中加入2.5mL的病毒混懸液，37℃、5%CO2培養箱中靜置24 h。
（5）棄去病毒混懸液，每皿加入2mL細胞基礎培養基。
（6）24 h后，為提高感染效率，重復感染一次。
（8）第二次感染結束后，將感染了病毒的細胞消化傳代，用NSC M重懸，按2×105每35 mm培養皿的密度接種于提前包被了PDL和laminin的皿中。
（9）每日更換NSC M并觀察。待出現了神經干細胞克隆并長至足夠大小后（圖5-5）用口吸管和玻璃管挑取克隆至提前鋪有PDL和laminin的四孔板中培養擴增，每孔放置一個克隆，培養液為NSC M。
