小鼠海馬神經元細胞分離培養的步驟詳解

  小鼠神經元細胞中神經元是構成神經系統結構和功能的基本單位。細胞體位于腦、脊髓和神經節中，細胞突起可延伸至全身各器官和組織中。
   （1）75%（體積分數）酒精消毒新生24h內的健康C57小鼠，在無菌條件下脫頸處死，剪開頭皮及顱骨，取出腦組織，置于盛冷的pH7.2，無鈣、鎂的D-Hank's液的平皿中（下置冰袋）。

   （2）無菌分離海馬組織。保持腦組織背面朝上，在鏡下小心翻開大腦皮質，暴露海馬，用眼科剪或尖鑷分離海馬周圍組織，取出放入盛有D-Hank's液的平皿中。

   （3）用虹膜剪將組織剪切成1mm3左右的組織塊，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用 20min，期間振搖 2~3 次。

   （4）棄去上清液，加入完全接種液終止消化，漂洗2次。巴斯德吸管輕輕吹打 20次，制成細胞懸液，靜置 2min。

   （5）懸液收集于新的離心管，離心（1000rpm，10 min，4℃），棄去上清液。加入完全培養液重懸，200 目不銹鋼網過濾。

   （6）將濾液進行臺盼藍拒染試驗,血細胞計數板鏡下計數。以 8.0 ×104至 1.0 ×105/mL的密度將細胞以400μL/孔接種到預先用L-多聚賴氨酸包被的24孔培養板或 100μL/孔接種 96 孔培養板。

   （7）置 37℃、5%CO2培養箱培養 4-6h，全量更換為無血清培養液。

   （8）體外培養第3d，加入Ara-C-工作液，以抑制非神經細胞過度增殖，作用 24 h后吸出。

   （9）此后每 3d半量換液1次 , 體外培養第 7～21d的細胞用于實驗。