實驗概要
小鼠胚胎干細胞向神經干細胞的定向誘導分化
主要試劑
無菌水、0.1%明膠、DPBS、0.05%Tripsin、fibronection、Laminin、細胞基礎培養液、N2B27培養液、mES培養液C、小鼠EB培養基、神經干細胞培養液（NSC培養液）
主要設備
35 mm、100 mm培養皿、12孔板、移液槍、口吸管、玻璃管
實驗步驟
（1）．經由EB分化法（Lee SH,2000）
①提前1 h用0.1%明膠包被35 mm培養皿，孵育1 h后棄去明膠。
②將在飼養層上培養的多能性干細胞以0.05% Trypsin消化2min，加等體積細胞基礎培養液終止消化，1000rpm離心5min，棄上清并用神經干細胞培養液重懸細胞，以每皿2×105個細胞密度加入明膠包被的35 mm培養皿，在37℃、5%CO2培養箱中靜置30 min，吸取上清以去除貼在明膠上的滋養層。
③把上一步驟吸取的上清液1000rpm離心5min，棄上清并用EB培養基重懸細胞，以每皿1×106個細胞的密度接種于100 mm培養皿中，在37℃、5%CO2培養箱中靜置48 h。以后每天向每個100 mm培養皿中補加3mL EB 培養基。
！注意：培養皿接種后，要將細胞懸液充分搖勻后再放入培養箱，否則EB之間容易黏合在一起。
④分化第5天,在12孔板中每孔加入500μL 20μg/mL的fibronectin，室溫靜置過夜。
⑤分化第6天,棄去12孔板中的fibronectin，每孔加入1mL EB培養基。吸取100 mm培養皿中的EB球置入12孔板中，每孔放置20個左右EB球。
⑥.EB接種后第2天貼壁，棄去EB M，每孔加入2mL N2B27 培養液。以后每天半量更換新鮮的N2B27 培養液。
！注意：在12孔板中吸液和加液要輕，槍頭緊貼皿壁，以免吹起EB球。
⑦ EB接種后第6天，此時可看見貼壁的球中爬出大量神經細胞，偶爾還可見神經元（圖5-2B）
⑧.0.05%Tripsin消化2min，用等體積的10%FBS終止，1000rpm離心5min，用NSC M重懸細胞，并以每皿5×105個細胞的密度種植于35 mm培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中培養。
⑨ 當細胞密度到達80%時進行傳代，一般3-4d傳代一次。經過幾次傳代后，神經干細胞以漂浮的神經球形式生長。吸取神經球，以每皿5×105個細胞的密度種植于提前包被PDL和laminin的35
mm培養皿中，37℃、5%CO2培養箱中培養擴增。PDL和laminin的包被方法為：在新的35 mm培養皿中每皿加入50μg/mL的PDL
1mL，室溫靜置過夜；第二天棄去皿中的PDL液體，用無菌水沖洗皿底3遍，室溫靜置晾干，每皿加入5μg/mL的laminin
1mL，37℃、5%CO2培養箱中靜置過夜，接種前棄去laminin。
（2）單層培養分化法(Ying QL,2003; Xu J,2012)
①提前1 h用0.1%明膠包被35 mm培養皿，孵育1 h后棄去明膠。
②將在飼養層上培養的多能性干細胞以0.05%Tripsin消化2min，加入等體積10%FBS終止消化，1000rpm離心5min，棄上清并用PSC 培養基重懸細胞，以每皿2×105的細胞密度加入明膠包被處理后的35 mm培養皿，在37℃、5%CO2培養箱中靜置30 min，吸取上清以去除貼在明膠上的飼養層細胞。
③把上一步驟吸取的上清液1000rpm離心5min，棄上清并用PSC M重懸細胞，以2×105每皿的密度接種于35 mm培養皿中
④ 小鼠胚胎干細胞在0.1%明膠包被的無飼養層條件下培養3代以上，每2天傳代一次，傳代時用0.05%的Tripsin消化1min，以等體積的10%FBS終止消化，1000rpm離心5min，mES培養液C重懸。
⑤按第④步的描述消化傳代并以N2B27培養液重懸細胞，以每皿9.6×104個細胞的密度接種于棄去提前1h包被0.1%明膠的35 mm皿中，并加入1μM的RA。
⑥ 每日更換新鮮的加有RA的N2B27 培養液，4天后可見到花環狀神經管結構（rosette）
⑦ 再過6天后傳代并以NSC 培養液重懸，以每皿5×105個細胞的密度接種于提前包被了PDL和laminin的35 mm培養皿中，培養液為NSC培養液，37℃、5%CO2培養箱中培養擴增。