實驗概要
了解小鼠胚胎干細胞的培養方法。
主要試劑
1. 貯存液
DMEM(高糖)
胎牛血清
L-谷氨酰胺（200mM）
MEM NEAA（10mM）
HEPES（1M）
β-巰基乙醇（55Mm）
轉鐵蛋白50mg/ml
胰島素5mg/ml
亞硒酸鈉300μM
黃體酮（20μM）
腐胺（100μM）
PEST（P104U/ml S104μg/ml）
層粘連蛋白（100μg/ml）
纖維連接蛋白（250μg/ml ）
堿性rhFGF, （10μg/ml）
2. 包被液的準備
多聚-L-賴氨酸，15μg/ml
把75ml多聚-L-賴氨酸和425ml 1×PBS混合。貯存在4℃。
纖維結合蛋白，1μg/ml
把0.5ml纖維結合蛋白和500ml 1×PBS混合。
3. 凍存液
90％HS和10％DMSO
4. 0.1％geltin溶液
培養基：
1. ES
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基，0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃，時間不要超過2周。
2. EB
配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（該溶液也能用于ES培養基--見前述）。分裝在50ml
離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。將21ml該溶液和50ml
FBS加入450mlDMEM中制備培養基，0.2μm濾膜過濾。貯存于4℃。
3. ITSFn and N3（分化培養基）：
配制一20×不含DMEM/F12的溶液。分裝在15ml 離心管中，（稀釋為1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm濾膜過濾，貯存在-20℃。將該溶液加入DMEM/F12中制備培養基，貯存于4℃。
實驗步驟
1. 復蘇細胞
細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結晶的形成，結晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。
步驟：
1) 從液氮中取出一管細胞；
2) 將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內溶液恰好完全溶解）；
3) 將細胞轉移到一15ml Falcon管中；
4) 加入5ml ES培養基（用培養基沖洗凍存管）；
5) 離心3分鐘；
6) 棄上清，用2ml ES培養基重懸細胞，至少吹打10次；
7) 接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養皿；
8) 孵育。
2. 凍存細胞
步驟：
1) 1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養皿內；
2) 用細胞刮刀收集細胞；
3) 將細胞轉入15ml 離心管管內并離心3分鐘；
4) 棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10 cm的培養皿用2ml，15cm的培養皿用6－7ml。）
5) 分裝于凍存管內，每管1ml；
6) 置－80℃過夜，第二天移入液氮。
3. Geltin（明膠）包被
準備500ml 0.1％geltin溶液
1) 將0.5 g明膠溶解在500ml無鈣鎂的PBS中（50－65℃水浴15～30分鐘）。
2) 最好在溶液沒有冷卻的情況下通過0.22 μm濾膜過濾，貯存在4℃。
4. 包被培養板或培養皿
1) 加入足量的明膠溶液覆蓋培養平面（15 cm培養皿加2ml，10 cm培養皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆蓋培養表面就行了。）；
2) 置室溫30分鐘；
3) 去除明膠溶液，將培養板貯存在包裝袋中室溫放置，最好將板子平放或倒扣，以免明膠污染蓋子和流出培養板。
4. 細胞傳代
建議每2天傳代細胞一次，過度生長的細胞會降低細胞的自然分化率，我們建立了一種純化方法來去除分化細胞，在將細胞接種在明膠包被的培養板上之前，通過將分化細胞黏附在沒有包被的組織培養板上去除分化細胞。純化步驟包含在下面的方法中。
1) 去除培養液；
2) 無鈣鎂PBS（Gibco）洗滌；
3) 加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分鐘。
4) 加入ES培養基使胰酶失活；
5) 將細胞轉入15 ml離心管中離心3min；
6) 去除上清，將細胞重懸于2 ml ES培養基，至少吹打10－20次。
如果加入培養基的量較少會比較容易將細胞團弄散分開。ES細胞有聚集成團的傾向，傳代過程中仔細將細胞弄散分開很重要。這樣可能會減少細胞的自然分化。
7) 將細胞接種在沒有包被的組織培養皿中（使用和一開始同樣規格的培養皿）放入溫箱2小時（分化細胞在該時間內將黏附，而ES細胞仍將保持懸浮）；
8) 將含有細胞的培養基轉入geltin包被的組織培養皿。吹打以確保細胞被分散開（前面已經提到--ES細胞有聚集成團的傾向）
9) 建議按1：4－1：10的比率傳代 (ATCC)
保持細胞的傳代比率很重要，以我們的經驗，1：8的比率是好的，可以使細胞的自然分化降到最低。當你使用不同規格的培養板進行細胞傳代可以使用表1來計算傳代比率。
5. 包被過程
1) 加入多聚-L-賴氨酸，至少2－3小時（過夜也行）
2) 吸出多聚-L-賴氨酸
3) 加入纖維結合蛋白，大約1－2小時
4) 吸出纖維結合蛋白，放置30分鐘晾干
5) 貯存在4℃
24孔板用200μl，6孔板用500μl。震蕩培養板確保溶液能夠覆蓋蓋玻片或培養孔。有時需要劇烈震蕩培養板。
6. 體外分化方法
1) ES培養基
在LIF存在的條件下維持細胞培養
2) EB培養基
使用細菌培養皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。
A．分散純化細胞（參見上面的細胞傳代部分）
B．純化2小時后將細胞轉入含有ES培養基的50ml Falcon管中，計數細胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。
C．用2mlEB培養基重懸細胞，吹打至少10次制成單細胞懸液
D．一個15cm的細菌培養皿接種4～5×106個細胞（1個完全融合的組織培養皿通常足以接種4個同樣規格的細菌培養皿）。
E．2天后更換培養基
將胚狀體轉入錐形管中放置3～5分鐘使細胞沉降。棄去上清，將細胞重懸于新鮮培養基并接種在新的細菌培養皿中。
F．用EB培養基培養的第4天將細胞轉入沒有包被的組織培養皿中（這即是細胞的移植步驟）。1個組織培養皿之中放置1個細菌培養皿，在進行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規格的培養板上。
形成胚狀體需要4天時間。在EB培養基中再培養1天使胚狀體粘附在組織培養皿的表面。這一天被認為是第2步和第3步的分界。
3) ITSFn培養基
在最少量培養基中選擇神經前體細胞
A．在胚狀體接種在組織培養皿一天后將培養基換成ITSFn培養基
B．并非所有胚狀體在這一時期都已經發生粘附，因此在移除培養基時要小心謹慎以使大部分胚狀體留在培養皿內。
C．保持細胞在ITSFn中培養大約10天，根據需要更換培養基--大約每隔一天。
觀察細胞形態，神經樣細胞大約出現在第4到第7天。當神經樣細胞能夠被鑒別時，轉入到第4步。步驟的轉換應該在神經前體細胞出現第一個清晰的標志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
4) N3培養基＋bFGF
通過將神經前體細胞培養在含有10ng/ml bFGF的培養基中進行擴增。
A. PBS洗滌，加入1-2ml 胰酶
B．37℃孵育5分鐘
C．用4mlEB培養基終止胰酶活性，將細胞轉入錐形管中放置3～5分鐘移出細胞團，將上清移入一新的離心管離心。
D．將細胞重懸于含有bFGF的N3培養基。
E．將細胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養板或6孔培養板，6孔培養板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使最大可能的獲得樣品數量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
F．2天后更換培養基
5) N3培養基
通過撤除bFGF使神經前體細胞分化
A．細胞被接種在蓋玻片上4天后將培養基換成不含bFGF的N3培養基
B．根據需要換液（大約每隔一天）
C．分化10～15天后固定細胞
6) 移除培養基
PBS洗滌，加入4%福爾馬林，室溫放置30分鐘，PBS洗滌2次，儲存于PBS。長期儲存使用含0.01％疊氮化納的PBS
7) 移植細胞的準備
細胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應于體外分化過程中的第2步末細胞被轉種到組織培養板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10cm的培養皿。
移植：
A．將胚狀體轉移至一15ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。
細胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細胞（包括死細胞）而這些細胞可以被離心下來。
B．去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1×PBS中
C．離心3分鐘
D．去除上清加入1×胰酶（10cm的培養皿加1ml）
E．37℃水浴5分鐘
F．加入5mlEB培養基小心吹打約10次
小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。
G．離心2分鐘
H．吸出上清將細胞重懸于500μl EB培養基
I．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
J．離心2次
K．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養基
8) 煙酸己可堿標記ES細胞進行移植
A．準備一10μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）
B．加入1mg（你能稱到的最小量）到5ml EB培養基（制成200μg/ml）
C．將溶液稀釋成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培養基）
D．如前所述將細胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養基中制備ES細胞懸液，
E．將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘
F．離心2分鐘
G．吸出上清將細胞重懸于2ml EB培養基
H．重復一次
I．離心2分鐘
J．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養基并置于冰上。