一、酶活性的測定
1. 原理
利用海藻糖酶水解一分子海藻糖生成兩分子葡萄糖,然后測定生成的葡萄糖濃度作為海藻糖酶的活性濃度。
2. 步驟
將尿液標本0.5mL通過5mmol/LpH為6.2的磷酸鹽緩沖液平衡的SephadexG-25柱,以除去內源性葡萄糖。收集含蛋白的部分,將體積調整到1.5ml。將洗脫下來的標本0.9mI。加上0.1mL 0.25mmol/L的海藻糖,混合后于37℃溫育120min。生成的葡萄糖用POD-GOD方法測定,以每小時每升尿液中釋放多少umol的葡萄糖量作為海藻糖酶的活性濃度。
3. 結果
IshiharaR等測定健康組尿海藻糖酶的活性是26.6±14”umol·h-1.gcreatinine-1。
二、酶含量的測定
1. 原理
利用抗海藻糖酶單克隆抗體的夾心ELISA方法檢測酶蛋白的含量。
2. 步驟
國外報導用重組海藻糖酶和人工合成的海藻糖酶多肽片段制備出抗人海藻糖酶的單克隆抗體,然后經過包被、封閉等步驟,用夾心ELISA方法測定出酶蛋白的濃度。
3. 結果
IshiharaR等用ELISA法測定健康組尿海藻糖酶蛋白的濃度為466±343ng·gcreatinin-1。健康實驗者的尿海藻糖酶活性和含量之間有正相關(p<0.01,r=0.15)。這些數值均無性別及年齡差異。
海藻糖酶在正常人尿液中的活性很低,而且尿液中該酶活性是否能反映真實酶濃度也不確定。急性腎衰患者尿液中存在75kDa和30kDa酶蛋白分子,30kDa酶蛋白分子也許是蛋白水解酶降解完整海藻糖酶的產物,盡管尿液中存在75kDa酶蛋白分子,該患者尿海藻糖酶活性并不升高,說明尿液中酶活性已喪失,由于經典測酶活性方法的影響因素多而且靈敏度和特異性均不及免疫學方法測酶質量。因此,尿海藻糖酶的定量測定優于傳統的酶活性測定。