巨噬細胞的分離和純化

巨噬細胞的分離

1）從小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分離巨噬細胞

1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）無菌的液體石蠟或巰基乙酸肉湯或4％淀粉肉湯。3～4天以后收集腹腔細胞。

2．如要收集腹腔靜置巨噬細胞，不注射刺激物，直接從這一步開始。放血處死動物，以減少腹腔中的紅細胞。消毒腹部，沿腹中線注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中預冷的無菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。輕輕按摩腹部5分鐘。

3．以下均無菌操作。剪開腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣容量的預冷PBS-H沖洗腹腔2～3次。合并滲出液于離心管中，4℃離心250×g 10分鐘，去上清液。

4．用預冷的RPMI-1640培養液洗滌細胞3次，每次4℃離心250×g 10分鐘，去上清液。用預冷的適量RPMI-1640培養液懸浮細胞，臺盼藍染色計數細胞并決定細胞活力。

2）家兔肺泡巨噬細胞的分離和純化

1．取2～3公斤重的家兔，耳緣靜脈注射10ml空氣處死動物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉動物。仰臥固定，消毒胸部，剪開胸壁。以下過程注意無菌操作。小心從環狀軟骨下方剪下氣管，分離心臟和血管，取出肺，剪去脂肪和結締組織。用無菌紗布小心擦凈肺表面，稱重。

2．分離肺泡巨噬細胞：用夾子夾住氣管，使肺懸空。向氣管中注射40ml無菌的冷生理鹽水，讓生理鹽水進入全部肺泡。用鑷子提起氣管，從夾子下面剪斷氣管，將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法，用40ml無菌冷生理鹽水沖洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3．分離肺組織中的巨噬細胞：取出肺泡巨噬細胞后，剪去氣管，將肺組織放在有冷RPMI-1640培養液的平皿中。平皿置冰上，用吸滿冷RPMI-1640培養液的20ml注射器接23號針頭，一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織，直到肺組織與支氣管樹全部分離。使肺組織通過200目的鋼絲網，分離單個細胞。

4．以下過程均在4℃中進行。分別處理肺泡巨噬細胞和肺組織中的巨噬細胞：離心200×g 10分鐘，去上清液。輕彈試管，懸浮細胞，加入10ml低滲液（20mmol/L Tris, 0.75%氯化銨，pH7.4），37℃處理3～5分鐘，溶解紅細胞。紅細胞通常分別占肺泡巨噬細胞和組織巨噬細胞的1％和10％。也可以不用低滲處理，直接在淋巴細胞分離液上分離巨噬細胞。

5．離心200×g 10分鐘，去上清液。用RPMI-1640培養液洗滌細胞一次。將細胞懸液加在淋巴細胞分離液（比重1.077）上，離心400×g 20分鐘，收集交界面的巨噬細胞。棄去沉淀的死細胞和紅細胞。

6．用RPMI-1640培養液洗滌巨噬細胞2次。臺盼藍染色檢測細胞活力和細胞數，將細胞配成所需濃度。此時巨噬細胞活力可達90％以上，巨噬細胞占全部細胞的90％以上。

3）從小鼠脾臟、胸腺和骨髓中分離巨噬細胞

1．用外科方法無菌摘取小鼠脾臟和胸腺，置于盛有預冷RPMI-1640培養液（含1％小牛血清）的平皿中，剪去結締組織和脂肪。用無菌注射器芯將脾臟或胸腺擠壓通過200目的鋼絲網，獲得單個細胞。

2．離心200×g 10分鐘，去上清液。用含1％小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞配成約1×10⁸～5×10⁸/ml。

巨噬細胞的純化

1）用帖壁法純化巨噬細胞

1．用含20％～40％小牛血清的RPMI-1640培養液將巨噬細胞配成2×10⁶～4×10⁶/ml的濃度。以每平方厘米2×10⁵～4×10⁵個巨噬細胞的密度將細胞懸液接種到玻璃培養皿（瓶）或塑料培養皿（瓶）中。37℃ 5％ CO₂的飽和水汽二氧化碳培養箱中培養1小時或24小時。1小時培養節省時間但會丟失一些粘附力弱的巨噬細胞，而24小時可以得到較多的巨噬細胞。20％～40％的小牛血清可以減少B淋巴細胞的粘附。

2．搖晃培養皿（瓶），懸浮未粘附細胞，吸出細胞懸液。用預溫的Hanks液洗滌細胞3～4次。懸浮細胞可重復粘附，得到更多巨噬細胞。用適量含2.5mmol/L EDTA的無鈣鎂Hanks液消化細胞37℃ 15～30分鐘。用吸管吹打分離細胞，離心250×g 10分鐘，去上清液。

3．用預冷的Hanks液洗滌細胞3～4次，每次離心250×g 10分鐘，去上清液。最后用含10％小牛血清的RPMI-1640培養液懸浮細胞，臺盼藍染色計數細胞并決定細胞活力，將細胞配成所需的濃度。

2）用不連續密度梯度離心純化巨噬細胞

1．    取15ml離心管，將制備好的各濃度密度梯度材料按下濃上淡的順序依次分層加在離心管中，每個濃度2ml。最后加上上述巨噬細胞懸液3～5ml（約含2×10⁷～5×10⁷細胞）。

2．    4℃中，水平離心1000×g 30分鐘，垂直取出離心管，小心吸出各交界面的細胞。分別用預冷的含1％小牛血清RPMI-1640培養液洗滌各交界面細胞2次，每次200×g 10分鐘。用含10％小牛血清的RPMI-1640培養液將細胞配成所需的濃度。