巨噬細胞吞噬功能和殺傷功能的檢測

基本方案1 巨噬細胞吞噬功能的檢測

材 料

單核/巨噬細胞：如巨噬細胞株、小鼠腹腔巨噬細胞[單元6.1，需 用 1 0 %

豚蛋白胨或4 % (m /V ) 硫基乙酸鹽肉湯]，或 人 P B M C (單 元 8.1)

平衡鹽溶液（balanced salt solution， BSS)

細菌（如單核細胞增多性利斯特氏菌Li說 腦 E G D ) ，過夜培養，活

菌 或 加 熱 滅 活（見輔助方案）

正常血清，新鮮分離或新鮮融解，置冰上備用

含 5 % (v/v) FCS的 PBS，冰上預冷

含 30% (m A O 蔗糖的PBS (濾過除菌， 4°C可保存數月）

Diff-Quik 染 液（ Baxter Healthcare)

10 mmX75 mm聚丙烯塑料試管或聚苯乙烯塑料試管，帶蓋型

載玻片及蓋玻片

振 蕩 器（Labindustries)

Cytospin 2 型細胞甩片機（Shandon/Lipshaw)

1 . 加入1〇ml PBS,4℃， 250g離心2min，洗滌單核/巨噬細胞，重復洗滌一次，棄上清 。用 B S S 重懸細胞，調整濃度至2.5X 107個細胞/m l ，在 10m m X 75m m 帶蓋塑料試管中加入0. I m l 細胞懸液。

2 . 將利斯特氏菌懸液置渦旋振蕩器上混勻（約 2 X IO9 個細菌/ml) ，用 B S S 稀 釋 1 0 倍 。檢測巨噬細胞的吞噬功能時，細菌 經 B S S 稀釋前應徹底吸凈殘存的細菌培養基。

3 . 充分振蕩混勻細菌（使成為單細菌懸液），將 0.1m l 細菌懸液加入上述帶蓋型試管中(每管2. 5X I O7個細菌及2. 5 X I O 6 個細胞）。

4 . 加 入 50M1冰預冷的正常血清，再 加 入 B S S 至終體 積 lml，蓋緊試管蓋。將試管置于振蕩器上， 37°C ， 8r/m i n 往復 振 蕩 20?30 min (不 超 過 30 min)。

5a. 基本方法： 4°C ， 250 g 離 心 8 min，棄上清。加 入 2 倍體積冰預冷的B S S ，用吸管輕輕混勻細胞。重復洗滌細胞2 次 ，徹底除去胞外未被巨噬細胞吞噬的細菌。用冰預冷 的 5 % F C S /P B S 重 懸 細 胞 ，調 整 至 合 適 濃 度（一 般 加 入 2m l 后 ，細胞濃度為

IO6個細胞/m l 左右）。

5b. 更嚴格的方法：同步驟5a 洗滌細胞，但 最 后 用 I m l 冰預冷 的 B S S 重懸細胞。然后用 I m l 槍 頭 將 I m l 含 3 0 % 蔗 糖 的 P B S 加入試管底， 4°C ， 250 g 離 心 8 min。小心吸去 B S S 和蔗糖后，加入冰預冷的5 % F C S /P B S 重懸細胞沉淀，調 整 至 合 適 濃 度（一般 加 入 2m l 后 ，細胞濃度為IO6個細胞/m l 左右）。

6.將 0.1m l 細 胞 懸 液（約 IXlO5個細胞）加入甩片機中，室溫， 650r/min離 心 5 min，將細胞固定至載玻片上。對于體積較大的巨噬細胞，細胞數量可酌情減少。

7 . 按照說明書進行Diff-Quik染色。油 鏡 下（放 大 1000X ) 檢 測 200個以上巨噬細胞，計錄每個巨噬細胞吞噬的細菌數量，然后計算吞噬指數：

吞噬指數= 陽性吞噬細胞百分率(>1個細菌）X 陽性細胞中平均細菌數

輔 助 方 案 利 用 F I T C 區分胞外黏附和胞內吞噬的細菌

附 加 材 料

基本方案2 巨噬細胞殺傷功能的檢測

材 料

細菌(如單核細胞增多性利斯特氏菌、大腸桿菌或葡萄球菌），對數生長期。凍存的細菌接種于液體培養基后，培養過夜

平衡鹽溶液（BSS)

單核/巨噬細胞：如巨嗟細胞株、小鼠腹腔巨噬細胞[單元 6.1，改 用 1 0 % 豚蛋白胨或4 % (m A O 硫基乙酸鹽培養基]，或 人 P B M C (單元8.1)

正常血清，新鮮分離或新鮮融解，置冰上備用

含 5 % (m A O 正常血清的BSS，冰上預冷

無菌水

2 m l錐底聚丙烯塑料試管，帶 螺 口 蓋（Sarstedt)，或 IOmmX 75 mm帶蓋錐底聚丙烯塑料試管

振 蕩 器（Labindustries)

細菌培 養 板 ：如 T S A (tryptic soy agar) 培 養 板（Remel; 4°C 儲 存 ，用前預熱至 37℃

13 mmX IOOmm硼桂酸玻璃試管，帶 螺 口 蓋（Fisher或 Coring)， 無菌

1 . 將過夜培養的利斯特氏菌振蕩混勻，用 B S S 稀 釋 300倍 。在 I O m m X 75m m 帶蓋塑料試 管 或 2m l 螺口蓋塑料試管中分別加入下列成分：

0.1m l 巨噬細 胞 懸 液（2. 5 X 106個細胞）

0.3m l 稀 釋 后細菌懸液（2. 5X 106個細菌）

50ml正常血清，冰上預冷

補 充 B S S 至終體積Iml

如 懷 疑 巨 噬 細 胞（如人肺泡巨噬細胞）可能已吞噬其他細菌，應另外設置一組不加利斯特氏菌的對照組。

2 . 旋緊試管蓋。將試管置振蕩器上， 37°C ， 8r/m i n 往 復 振 蕩 15?20 min，使巨噬細胞充分吞噬細菌。充分洗滌去除未被吞噬的胞外細菌（見 基 本 方 案 1，步 驟 5a 或 5b)，將細胞重懸于I m l 含 5 % 血清的B S S 中。

3 . 取 4 只螺口玻璃試管，每 管 加 入 0.9m l 無 菌 水 。在 第 一 管 中 加 入 0.1m l 細胞懸液(水只裂解巨噬細胞），在余下的3 只試管中依次進行1 0 倍系列稀釋。不同試管間稀釋時需更換槍頭，并將細胞混勻。

4 . 將各試管中液體充分混勻，各 取 0.1m l 液體分別涂布在預熱至37°C 的 T S A 細菌培養板上。

5 . 將剩佘的未稀釋細胞懸液蓋緊。 37°C 孵 育 90?120 min，使巨噬細胞充分殺傷細菌。然后將試管置冰上，抑制細菌生長。將 細 胞 懸 液 進 行 1 0 倍系列稀釋并涂板，方法同上。

6 . 待涂布的液體被瓊脂吸收后，將細菌培養板倒置于37°C 孵 箱 ，培 養 24?28 h 。計數細菌克隆數，比較樣品孵育前后細菌克隆數的變化（如 37°C 孵育后細菌克隆數減少，說明細菌被巨噬細胞殺傷）。

細 菌 培 養 使 用 標 準 37°C 孵 箱 而 非 CO2飽 和 濕 度 細 胞 培 養 箱 ，對 細 菌 培 養 來 說 ，后 者 濕 度 過 高 。

輔助方案單核細胞增多性利斯特氏菌的制備

材 料

致病性單核細胞增多性利斯特氏菌（A T C C :15313株），或其他細菌，如從患者分離培養的細菌

胰 蛋 白 胨 肉 湯（Difco)

10m x n X 75m m 聚丙烯或聚苯乙烯塑料試管，帶蓋型

70°C 水 浴（推薦使用）

1 . 將適量細菌接種到胰蛋白胨肉湯中（接種量根據細菌保存方式而定，如凍存、保存在半固體斜面培養基上或肉湯中），在 37°C 水浴中振蕩培養至對數生長期（4?6 h)。

2 . 將每份0.5m l 菌液加到I O m m X 75m m 帶蓋聚丙烯塑料試管中，一80°C 保 存 備 用（可保存> 1 年）

。

3 . 臨用前將細菌解凍，用 吸 管 取 一 滴（約 30/xl) 加 到 5m l細 菌 培 養 基 中（如胰蛋白胨肉湯）。 培養過夜至細菌達對數生長晚期或平臺期（約 2X 109個活菌/ml)。

4 . 對數生長早期細菌：取 Im l 菌液加到新鮮肉湯中，繼續培養 4?6 h。

5 . 熱滅活細菌：將對數生長期細菌置 70°C 水 浴 ，滅 活 60 min。 4°C ， 900 g 離 心 20 min，棄上清。加 入 IOml P B S 洗滌細菌。最 后 用 P B S 重懸細菌，調 整 濃 度 至 1010個細菌/

m l 左 右 （過夜培養的細菌一般為 2 X 109個細菌/ml)。