差減cDNA文庫法
[第一條鏈cDNA合成]
1．合成第一條cDNA鏈時，所有試劑應按下列順序依次加入：
10×第一條鏈合成緩沖液 5.0μl
10mM dNTP Mix(1.4μg/μl) 2.5μl(終濃度1.25mM)
Linker primer(1.4μl，終濃度100μg/μl)
DEPc H2O
RNase block Ⅱ(1U/μl) 1.0
mRNA 1~5μg
混合，離心20秒鐘，室溫放置10分鐘
2．加入逆轉錄酶至1500U/ml，補水到終體積50μl。
3．混合，取出5μl放入含有0.5μg α-32P dATP（800Ci/mM），分別保溫在37℃ 1小時。
4．保溫后，帶有同位素的離心管放入-20℃保存，為以后分析用。第一條鏈cDNA混合物放在冰上。
[第二條cDNA鏈的合成]
1．對于總體積為45μl的第一條鏈混合物按下列次序依次加入：
第一條鏈混合物 45.0μl
10×第二條鏈緩沖液 20.0μl
0.1M DTT 8.0μl
10mM dNTP Mix 3.0μl
α-32P dATP（800Ci/mM） 1.0μl
dd H2O 115.0μl
2．混合后，加入：
RNase H (4.0U/μl) 1.0μl
DNA聚合酶（10.0U/μl） 7.0μl
第二條鏈反應體積200μl，在16℃水中保溫2.5小時，注意水溫不得超過16℃，保溫后立即放在冰上。
3．反應混合物隨后用酚，氯仿提取
4．用乙醇沉淀于，-20℃過夜。
5．次日，在4℃，以最大速度離心1小時。
6．用80%乙醇洗一次。
7．冷凍干燥cDNA。
8．最后沉淀物溶于43.5μl的dd H2O，取出4.5μl存入冰箱，作為第二條鏈分析用。
[填補cDNA末端]
1．在39μl的cDNA溶液中加入: 5.0μl的10×T4 DNA聚合酶緩沖液，2.5mM dNTP混合物。
2．反應物在37℃保溫30分鐘。
3．酚，氯仿提取。
4．酒精沉淀cDNA，-20℃至少沉淀30分鐘。
5．在臺式離心機中，以最大速度4℃離心60分鐘。
6．80%乙醇洗滌沉淀。
7．冷凍干燥cDNA沉淀。
[連接]
1．在反應總體積10μl中，應有：
1μl 10×連接緩沖液
1μl 10mM ATP
1μl (4 Weiss U/μl)
T4 DNA連接酶，連接子或者Adapter
2．反應在8℃保溫過夜。
3．保溫后，反應離心管放于70℃30分鐘，以滅活DNA連接酶。
[cDNA末端磷酸化]
1．70℃滅活反應后，稍微離心一下，置室溫5分鐘。
2．在反應混合物（10μl）中加入：
1μl 10×連接緩沖液
2μl 10mM ATP
1μl （10μ）DNA激酶
[限制性內切酶消化]以得到粘性末端
1．限制性內切酶消化DNA和載體。
2．在37℃保溫1~5小時，然后冷卻到室溫，如果選用定向插入，需用兩個不同的限制性內切酶消化，可得到兩個不同的粘性末端。
[cDNA大小的選擇]
1．在50μl的總體積中加入5μl 0×STE緩沖液。
2．Sephacryl S-400柱收集分離出的cDNA。
3．用酚，氯仿抽提。
4．酒精沉淀之后，懸浮cDNA在10μl的無菌水中。
[cDNA和載體連接]載體可用λgt10, λgt11或λZAPⅡ
cDNA (0.1~1μg) 2.5μl
10×連接緩沖液 0.5μl
10mM αATP 0.5μl
載體（1μg/μl） 1.0μl
T4 DNA連接酶（4 Weiss U/μl） 0.5μl
總體積為5μl
12℃保溫過夜，或4℃兩天，然后放在室溫下2小時。
[包裝]試劑由Strategene制備
1．包裝提取物從-70℃取出立即放入干冰中。
2．同時化解超聲提取物（黃色）。令在手指間溶解凍紅色管，到剛剛開始化時，加1μlDNA置于冰上。
3．快速加15μl超聲提取物到DNA中，仔細混合，避免氣泡，在室溫下保溫2小時（22℃）。
4．加500μl噬斑稀釋緩沖液（SM溶液），再加20μl氯仿，溫和的混合。
5．離心棄去噬菌體碎片。這個cDNA文庫可以測效價，保存于4℃中。
[制備ZAPⅡ文庫的單鏈cDNA]
1．在一個50ml的圓錐形離心管中，加宿主菌250μl到SM液中：
SM液：20mM Tris pH7.5
100nm NaCl
10nM MgSO4
0.2% Gelatin
2．37℃保溫15分鐘后，加5ml 2×YT（其中每升溶液含10g NaCl, 10g酵母提取物，16g胰酶解胨），37℃搖5小時。
3．然后在70℃保溫20分鐘。
4．4000g離心5分鐘，以除去細菌裂解碎片。回收上清液。這里應含有誘導得到的單鏈重組噬菌體，同樣還會有輔助噬菌體。滴度可以按細菌的形成單位來計算。
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