己糖激酶的測定實驗

直接測量己糖激酶的反應：

D-葡萄糖＋ATP → 6-磷酸葡萄糖＋ADP

簡單的光度測量是達不到的，葡萄糖的磷酸化最好用測量磷酸或者 ATP³² 標記的辦法。由于通過層析，G6P 的實驗必須完全與 ATP 和 ADP 分開，因此，建議應用 HPLC 方法。酶的實驗通常是酶與 G6P 脫氫酶反應偶聯:

D-6-葡萄糖＋ATP＋NADP^＋ → 6-磷酸葡萄糖＋ADP＋NADPH＋H^＋

這些反應都已經通過光度測量實現。當使用這個偶聯的系統，首先應該單獨進行 G6P 反應實驗，然后在己糖激酶的存在下用葡萄糖和 ATP 取代 G6P 繼續反應。

己糖激酶

三乙醇胺-HCl NaOHD-葡萄糖ATPMgCl2NADP6-磷酸葡萄糖脫氫酶

分光光度計

實驗所需「試劑」具體見「其他」

0.98 ml 實驗混合物

0.02 ml 酶樣品

25℃ 時，于 340 nm 處吸收值升高，ε₃₄₀＝6.3×10³ l/（mol·cm）。

試劑：

100 mmol/L 三乙醇胺-HCl/NaOH，pH 7.6（三乙醇胺-HCl，用 1 mol/L NaOH 調節）

1.0 mol/L D-葡萄糖（Mr＝180.2；18 g/100 ml）

0.1 mol/L ATP（二鈉鹽，三水合物，Mr＝605.2；605 mg 溶于 10 ml 水）

0.1 mol/L MgCl₂（六水合物，Mr＝203.3；203 mg 溶于 10 ml 水中）

0.01 mol/L NADP（二鈉鹽，Mr＝787.4；79 mg 溶于 10 ml 水中）

6-磷酸葡萄糖脫氫酶（商業品有 100～500 U/mg，準備時稀釋至大約 5U/0.1 ml）