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  • 發布時間:2020-10-19 16:09 原文鏈接: 帶你走出HPLC和UHPLC色譜柱的十大誤區(二)

    誤區6 UHPLC填料柱比常見的HPLC填料柱更容易堵塞

    隨著柱填料多孔材料粒徑的不斷減小,使得柱的主要硬件設計跟著一起發生變化。對于sub-2μm UHPLC柱的堵塞,是樣品和流動相物質倒伏在柱入口的結果。如果你在進樣前對樣品進行了凈化,如使用固相萃取、過濾或離心等,就可以避開任何污染問題。

    誤區7 保護柱是沒必要的

    使用保護柱有很多好處。首先,保護柱可以防止化學物質或顆粒物損壞分析柱。其次,相較之更換一根昂貴的分析柱,更換一根5mm 的保護柱只需要很少的花費。現代的保護柱具有幾乎無死體積、更換快速,以及適用于UHPLC的高壓等優點。

    誤區8 你不可以將HPLC色譜柱反接以便于沖洗掉其中的顆粒物

    實際上HPLC色譜柱的填裝壓力比最大使用壓力高很多(通常會高2倍)。如果裝柱時使用了恰當的勻漿劑,并且分配一定的時間使柱床穩定,一支填裝良好的色譜柱是完全可以雙向使用的。

    液相色譜柱上基本都有->標志,表示流動相的流動方向,有的在色譜柱上印有“Nerver Lot Flow in the Opposite Direction”字樣,翻譯成“決不能反沖”的意思,色譜柱可以反沖嗎、色譜柱能不能反沖的問題爭議很大,但在我們工作中,用色譜柱反沖技術修復色譜柱可以收到柱效提高、柱效恢復的效果。

    一、分析氨基酸的離子交換柱,使用一段時間反柱效明顯下降,用NaOH活化,達不到要求,但用NaOH反沖活化可迅速恢復柱效。

    二、色譜柱使用一段時間后柱效下降,此時可拆下柱入口端螺帽,去掉1-2mm被污染填料,再用相同填料填滿,然后用流動相反沖一下,可使柱效恢復,因反沖可以改善柱頭死空間。

    三、因反沖可把沉積在過渡板上的細微顆粒沖走,有時也可用反沖技術使柱壓降低。

    反向使用色譜柱有一個例外,就是生產商在色譜柱的進樣端使用了孔徑更大篩板的情況,反向使用可能會將填料從柱床沖出。如果制造商在柱的入口處使用的是高孔隙率的玻璃料,那么將柱反沖的話,可能會將柱填料從填充床上沖洗掉。

    色譜柱在工廠填裝時,出口端的篩板孔徑必須比色譜柱中最小顆粒的粒徑還要小。譬如,色譜填料平均粒徑是5μm,粒徑分布范圍是3-7μm,出口端篩板孔徑必須小于3μm,使填料沒有可能從柱床跑到色譜柱篩板外面。

    大多數生產廠家選擇的篩板孔徑是2μm。 至于某些廠家兩端的柱篩板孔徑不一樣,一般是進樣端大些,出樣端小些。因此,一些制造商會在柱子標簽處放置一個箭頭指示,表明必須僅在一個方向上使用。可以肯定有這種可能性,所以一個色譜工作者應該好好閱讀色譜柱手冊或說明書,或與制造商確定這根色譜柱是否可以反沖。

    誤區9 色譜柱填料粒徑越小、壓力越高,分離效果越好

    超小的粒徑以及超高的柱壓,并不一定是色譜工作者的最佳選擇!現代色譜柱的柱特性研究已經引發出一些新方法來評估一根色譜柱的性能。例如,采用新的表面多孔材料的色譜柱,其柱效與sub-2μm UHPLC柱效一樣好,然而與常規的LC填料色譜柱比起來,柱壓很低。

    誤區10 柱壓不會影響色譜分離效果

    色譜的很多參數都是受柱壓影響的,包括部分溶質的摩爾體積、停滯體積、柱孔隙度、保留因子、流動相密度、介電常數、固定相結構、pH值和電離常數等。為什么柱壓引起了越來越多的關注呢?原因是市售的色譜儀很多是超高壓色譜儀和色譜柱。

    當色譜柱在約2000psi(13.789MPa)壓力下運行時,即使保留時間上存在小差異,也并不會引起我們的注意;特別是如果重復性較好及定量不受影響的時候。但是,當柱壓接近2000psi(13.789MPa)時,柱壓的影響可能就相當明顯了。


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