過氧化物酶標記測定法
原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養的或從組織中分離的細胞凋亡測定。
一、試劑配制
1、磷酸緩沖液PBS（pH7.4）：磷酸鈉鹽 50mM，NaCl 200mM。
2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS緩沖液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS緩沖液 98.0ml。
4、TdT酶緩沖液（新鮮配）：Trlzma堿 3.63g用 0.1N HCl調節pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸鈉 29．96g和氯化鈷0.238g。
5、TdT酶反應液：TdT酶32μl；TdT酶緩沖液 76μl，混勻，置于冰上備用。
6、洗滌與終止反應緩沖液：氯化鈉 17. 4g；檸檬酸鈉 8.82g；ddH2O 1000ml
7、0.05％二氨基聯苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 臨用前過濾后，加過氧化氫至0.02%。
8、0.5％甲基綠（pH4.0）：甲基綠0.5g；0.1M乙酸鈉100ml。
9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10、 過氧化物酶標記的抗地高辛抗體（ONCOR）
二、實驗步驟
1、標本預處理：
（1）石蠟包埋的組織切片預處理：將組織切片置于染色缸中，用二甲苯洗兩次，每次5min。用無水乙醇洗兩次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室溫水解15min，去除組織蛋白。用蒸餾水洗4次，每次2min，然后按下述步驟2進行操作。
（2）冰凍組織切片預處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中，于室溫固定10min后，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃處理5min，去除多余液體。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。
（3）培養的或從組織分離的細胞的預處理：將約 5 × 107個/ml細胞于 4％中性甲醛室溫中固定 10min。在載玻片上滴加 50～100μl細胞懸液并使之干燥。用PBS洗兩次，每次5min，然后按下述步驟2進行操作。
2、色缸中加入含2％過氧化氫的PBS，于室溫反應5min。用PBS洗兩次，每次5min。
3、用濾紙小心吸去載玻片上組織周圍的多余液體，立即在切片上加2滴 TdT酶緩沖液，置室溫1～5min。
4、 用濾紙小心吸去切片周圍的多余液體，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反應液，置濕盒中于37C反應 1hr（注意：陰性染色對照，加不含TdT酶的反應液）。
5、將切片置于染色缸中，加入已預熱到37℃的洗滌與終止反應緩沖液，于37℃保溫30min，每10min將載玻片輕輕提起和放下一次，使液體輕微攪動。
6、 組織切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加兩滴過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，于濕盒中室溫反應30min。
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在組織切片上直接滴加新鮮配制的0.05％DAB溶液，室溫顯色3～6min。
9、用蒸餾水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
10、于室溫用甲基綠進行復染10min。用蒸餾水洗3次，前兩次將載玻片提起放下10次，最后1次靜置30s。依同樣方法再用100％正丁醇洗三次。
11、用二甲苯脫水3次，每次2min，封片、干燥后，在光學顯微鏡下觀察并記錄實驗結果。
三、注意事項
一定要設立陽性和陰性細胞對照。陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1μM）處理3-4hr的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。陰性對照不加TdT酶，其余步驟與實驗組相同。
丁香網友醫琳師妹所作的PC12細胞培養方法以及誘導凋亡的方法：
PC12細胞培養方法
一、器具：
1、培養皿（35mm）（或50cm2培養瓶）
2、6孔（35mm）培養板、24孔培養板
3、滴管
4、小青瓶
5、100ml、250ml玻璃瓶
6、翻口橡皮塞
7、燒杯：1000ml、500ml、100ml、50ml
8、容量瓶：1000ml、500ml、100ml
9、量筒：50ml、100ml、250ml
10、玻璃棒
11、pH試紙
12、濾器（0.22μl，γ射線菌一次性使用）
13、注射器：10ml、20ml
14、24mm×24mm蓋玻片
二、器具處理：
玻璃器皿、塑料器皿，予清洗、泡酸、三蒸水沖洗，干燥后備用。然后高壓蒸氣滅菌，置超凈臺紫外線燈照，風機抽干。
三、試劑：
1、培養基：DMEM（高糖）（或RPMI-1640）
2、馬血清（56℃，30分鐘滅活）
3、胎牛血清（56℃，30分鐘滅活）
4、青霉素
5、鏈霉素
6、NaHCO3
7、HCl
8、谷胺酰胺（選用）
9、神經生長因子（選用）
10、磷酸二氫鈉
11、磷酸氫二鈉
12、氯化鈉
13、多聚甲醛
14、胰蛋白酶
15、NaOH（選用）
16、多聚賴氨酸（或鼠尾膠）
17、D-Hank’s液
18、乙醇（無水、75%、95%）
四、配試劑：
1、DMEM不完全培養基：
DMEM
Hepes 3.08g
NaHCO3 3.7g
100U/ml青霉素/100mg/L鏈霉素
（調PH至7.2-7.4），不加血清為不完全培養基。
2、100U/ml青霉素/100mg/L鏈霉素：
青霉素80萬U+NS→40ml
鏈霉素100mg/L+NS→50ml取40ml
混成80ml，抽濾分裝，4℃保存。
3、DMEM完全培養液
DMEM
10%胎牛血清（已滅活）
5%馬血清
調pH7.2-7.4
加100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素約1ml
4、RPMI1640不完全培養液：
RPMI1640，25mM HEPES，用5%NaHCO3調節pH至7.4，滅菌后4℃保存，即：
RPMI-1640 10.4g
Hepes 3.58g
三蒸水 1000ml
1N NaHCO3（或NaOH）調pH值至7.2-7.4抽濾分裝90ml/瓶，4℃或-20℃凍存。
5、RPMI1640完全培養液：
25mM HEPES，5μg/ml胰島素，5μg/ml轉鐵蛋白，100U/ml青霉素，100 mg/ml鏈霉素及20%FCS，用5%NaHCO3調節pH至7.4，滅菌后4℃保存。
RPMI-1640不完全培養液，加100U/ml青霉素/100mg/ml鏈霉素，臨用前加入10%或20%FCS（v/v，胎牛血清），用1N NaHCO3調節pH值7.4，抽濾滅菌后4℃保存。
6、0.25%胰蛋白酶（DMEM配）
胰蛋白酶250mg
DMEM 100ml
抽濾分裝小青瓶，-20℃凍存
7、0.25%胰蛋白酶（RPMI 1640配）
胰酶250mg，加RPMI 1640 100ml，用0.1N NaHCO3調節pH至7.4，滅菌后4℃保存。
8、 Hank’s平衡鹽溶液：5.4mM KCl, 0.3mM Na2HPO4, 0.4mM KH2PO4, 4.2mM NaHCO3, 1.3mM CaCl2, 0.5mM mgCl2, 0.6mM MgSO4, 137mM NaCl, 5.6 mM D-葡萄糖，0.02%(w/v)酚紅。
9、0.1M pH7.4 PBS:
137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4?7H2O, 1.4mM KH2PO4。
10、1%多聚甲醛：多聚甲醛1g，加0.01M pH7.4 PBS至100ml。
11、抗體稀釋緩沖液：0.01M PBS, 0.1%BSA, 0.1Na3N。
12、小牛血清：
56℃，滅活30分鐘
分裝小青瓶，10ml或20ml/瓶
13、馬血清：
56℃，滅活30分鐘
分裝小青瓶，10ml或20ml/瓶
14、0.1M PBS:
137mM NaCl
2.7mM KCl
4.3mM Na2HPO4?7H2O
1.4mM KH2PO4
15、7.4%NaHCO3
NaHCO3 7.4g
雙蒸水 100ml
抽濾分裝小青瓶，4℃保存。