切口平移(nick translation)是制備核酸探針的常用方法之一。該方法用 DNase Ⅰ在雙鏈 DNA 內部切開若干個單鏈切口形成3'-OH 末端,而不打斷 DNA 的雙鏈結構;用大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ的5'→3'核酸外切酶活性,從游離5'端降解雙鏈 DNA,又因 DNA 聚合酶Ⅰ具有5'→3'聚合酶活性,將游離核苷酸加在3'-OH 端上,使切口沿著5'→3'方向移動,如以放射性同位素或生物素標記的核苷酸置換原先 DNA 鏈中存在的核苷酸,就可制備出同位素標記探針或生物素標記探針。此外,大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ還具有3'→5'核酸外切酶活性,可從游離3'-OH 末端降解雙鏈或單鏈 DNA,雙鏈 DNA 中3'→5'核酸外切酶活性可被5'→3'聚合酶活性阻斷。
切口平移法標記探針的步驟:
(1)模板 DNA 的制備
用限制性內切酶將載體上的外源 DNA 酶切并進行瓊脂糖凝膠電泳回收純化,瓊脂糖殘留可抑制切口平移反應,因此徹底清除瓊脂糖至關重要。也可以用帶有外源 DNA 克隆片段的重組載體為模板來切口平移制備探針。
(2)切口平移標記
將模板 DNA 水溶液、DNase Ⅰ、未標記的三磷酸單核苷酸混合物、切口平移標記緩沖液、DNA 聚合酶Ⅰ、32P 標記的核苷酸依次加入反應管,14℃保溫20min。
(3)純化標記探針,測定活性,-20℃保存,1～2周內可用。