細胞增殖是生物體的重要生命特征,細胞以分裂的方式進行增殖。單細胞生物,以細胞分裂的方式產生新的個體。多細胞生物,以細胞分裂的方式產生新的細胞,用來補充體內衰老或死亡的細胞;同時,多細胞生物可以由一個受精卵,經過細胞的分裂和分化,最終發育成一個新的多細胞個體。必須強調指出,通過細胞分裂,可以將復制的遺傳物質,平均地分配到兩個子細胞中去。可見,細胞增殖是生物體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎。
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一、MTT
又稱MTT比色法,是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值,可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內,MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點:由于MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶于水,需被溶解后才能檢測。這不僅使工作量增加,也會對實驗結果的準確性產生影響,而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。
二、CCK-8
Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒,是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成橙黃色的formazan。細胞增殖越多越快,則顏色越深;細胞毒性越大,則顏色越淺。對于同樣的細胞,顏色的深淺和細胞數目呈線性關系。
CCK-8的原理跟MTT其實是相同的,不同之處在于CCK-8法生成的formazan是水溶性的,不需要再吸出培養液加入有機溶劑溶解這個步驟,因此可以減少一定的誤差。其他優點就是重復性優于MTT;對細胞毒性小;為1瓶溶液,不需預制,即開即用。
三、BrdU
Brdu,即5-Bromo-2'-Deoxyuridine,中文全名5-溴脫氧尿嘧啶核苷,為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期),活體注射或細胞培養加入,而后利用抗Brdu單克隆抗體,ICC染色,顯示增殖細胞。同時結合其它細胞標記物,雙重染色,可判斷增殖細胞的種類,增殖速度,對研究細胞動力學有重要意義。
但由于抗體分子量大,難于摻入并被有效檢測,因此BrdU檢測需采用DNA酶或HCl或加熱使DNA變性;這些處理方法會破壞抗原識別位點,此外許多細胞周期分析的染料都需要dsDNA,這種處理方法也使得同一樣本無法同時進行細胞周期分析。對于植物細胞等有細胞壁的分析,采用抗體檢測還需要消化細胞壁,細胞壁消化酶常含有一些雜質,會導致檢測的可靠性降低,同時BrdU檢測則需要進行長時間的孵育--幾個小時甚至過夜。
四、EdU
EdU(5-Ethynyl-2’- deoxyuridine)是一種胸腺嘧啶核苷類似物,能夠在細胞增殖時期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復制的DNA分子中,通過基于EdU與Apollo?熒光染料的特異性反應快速檢測細胞DNA復制活性,適用于細胞增殖、細胞分化、生長與發育、DNA修復、病毒復制、細胞標記示蹤等方面的研究,尤其適合進行siRNA、miRNA、小分子化合物及其他藥物的篩選實驗。
與BrdU檢測方法相比,EdU檢測方法更快速、更靈敏、更準確。EdU染料只有BrdU抗體的1/500,在細胞內很容易擴散,無需DNA變性(酸解、熱解、酶解等),可有效避免樣品損傷,而且無需抗原抗體反應,能在細胞和組織水平更準確地反映DNA復制活性。