在做層析實驗的時候可能時常會遇到一個問題：一次實驗可以上多少樣品呢？多也不是少也不是，上樣多了會造成一部分樣品損失或者達不到預期的分離效果，上樣少了無法充分使用層析柱還要增加重復實驗或者使用更大層析柱，真是件糾結的事情。我們今天要來給大家介紹的就是不同的層析柱應該如何確定上樣量。
層析柱上樣量由柱體積和所使用填料載量決定
● 柱體積（CV）：層析柱中裝填的填料的總體積，根據層析柱的截面積及填料裝填的高度計算得到。
● 載量：填料在一定條件下填料結合目的分子的能力，分為靜態載量和動態載量。
靜態載量（有效載量）：
在一定的條件下，可以結合在層析填料上的真實樣品的數量，它是使用真實的樣品和介質充分浸潤飽和，然后測定結合在填料上的樣品總量。pH、離子強度、添加劑以及樣品等因素都會影響有效結合載量。實驗條件改變，有效結合載量也會變化。
動態載量：
在一定的運行條件下，可以結合在層析柱上的樣品數量。除 pH，離子強度，添加劑以及樣品以外，運行流速也會影響動態結合載量。一般來說，流速越低，動態結合載量越高。如果流速接近于零，動態結合載量等于有效載量。
層析都是在一定流速下進行的，故填料的動態載量更能有效地用于上樣量的確定。對于特定填料或層析柱來說，說明書都會給出對于某種特定蛋白其動態結合載量，同時給出相應的測定條件，可作為實際實驗中上樣量的參考。如下圖給出了 HisTrap HP 的動態載量及測定條件：
● 若需要確定填料對于特定樣品在特定條件下的結合載量，可通過以下方法測定實際的動態結合載量：
① 步驟一：保證時間
在?KTA 上連接上相應填料的 1 ml 的 HiTrap 的柱子或者小試的層析柱（如果涉及到工藝放大，小試的層析柱的高度應該與工業柱子的高度一致，保證放大前后的樣品的保留時間也就是樣品與填料的接觸時間一致。
② 步驟二：充分平衡柱子
使用 5 個柱床體積的結合緩沖液（平衡緩沖液）充分平衡柱子。
③ 步驟三：計算動態載量
在一定的流速下（例如：線性流速 300 cm/h）連續上樣（真實的樣品），并且使用收集器收集穿透液，測定穿透液中的目標蛋白的含量或者活性。
上樣剛開始，280nm 曲線（A280）升高，此時目標蛋白大部分結合在柱子上，所以幾乎檢測不到目標活性（Activity）；隨著上樣體積的增加，漸漸達到柱子的載量，可以在穿透曲線中檢測到目標蛋白的活性。計算 QB,5%，即得到在一定流速下，一定緩沖液條件下的動態結合載量，其計算公式為：
C0 = 樣品中目標蛋白的濃度（concentration of target solute in feed）。
VA = 穿透曲線中目標樣品活性達到 5% C0 時上樣的總體積（volume applied until the conc. Of target solute in effluent has reached 5% of C0）。
VC = 總的柱床體積（total bed volume）。
QB,5%： 一般可以根據真實的目標或者實際工藝計算 QB,5% 或者 QB,10% 作為動態結合載量。確定了使用的層析柱體積以及相應填料的載量，層析過程中上樣量也就很容易確定了。
舉一反三
聊完了層析柱上樣量和體積與填料載量的關系之后，讓我們來看一看根據層析五大原理，不同類型的層析實驗應該如何保證上樣量呢？
⑴ 非吸附性層析 - 凝膠過濾
組分分離：如脫鹽、緩沖液置換等實驗，上樣體積最大可達 30% 的柱體積，通常建議為 10%-20% 柱體積。
精細分離：若使用凝膠過濾進行高分辨率的組分分離，推薦使用層析柱體積 0.5%-4% 的上樣體積，不同比例取決于層析柱的類型以及樣品性質。通常為了得到較好的分辨率，上樣體積不超過 2% 的總柱體積。
分析分離或組分復雜的樣品分離：推薦使用 0.5% 的總柱體積上樣，可達到較好的分離效果。低于 0.5% 的樣品體積通常不能提高分辨率。
注意：由于凝膠過濾層析上樣體積受到限制，通常可對樣品進行濃縮，濃度低于 70 mg/mL 通常是可以接受的，但要根據不同樣品具體性質確定（考慮樣品穩定性、樣品黏度等）。
⑵ 吸附性層析
所使用的填料載量和柱體積共同決定。
⑶ 離子交換或疏水層析
真實上樣量：對于一個給定的離子交換或疏水填料，真實上樣量一般在 5~40% 的有效載量（因為帶有同樣性質電荷的雜質也會結合在柱子上）。
上樣量：樣品越復雜，上樣的比例越小。若樣品較簡單，且目標蛋白所占比例較大，上樣量可以達到 80% 的載量。
載量與上樣百分比： 填料結合載量為 25 mg/ml 的 1 ml 的柱子，如果使用 80% 的載量，可上樣 20 mg 的樣品；若使用 40% 載量，可上樣 10 mg 樣品；若使用 5% 的載量，可上樣 1.25 mg 的樣品。
測定樣品動態結合載量： 或者如果測定了真實樣品的動態結合載量，直接可以使用 70% 以上的動態結合載量上樣。
⑷ 親和層析
親和層析樣品的最大上樣量由填料的結合載量決定。
例如： Ni Sepharose HP 填料每毫升填料可以吸附 40 mg 的標簽蛋白，如使用 5 ml HisTrap，樣品最大上樣量為 200 mg，若樣品的濃度為 5 mg/ml，則最大的上樣體積可以達到 40 ml。
但實際上樣量根據樣品復雜程度不同有一定差異。 另外，如果使用小柱子純化大體積的樣品，樣品的準備是非常重要的，因為大量雜質可以會造成柱子堵塞，從而增加清洗成本，降低使用壽命。