1 材料與方法
1.1 材料 9~12d新生健康清潔級KM小鼠，雌雄不限，購自重慶醫科大學實驗動物中心。RPMI-1640干粉培養基，D-Hanks粉，標準胎牛血清，胰蛋白酶粉（1∶250）均購自Hy-Clone公司；青霉素鈉、硫酸鏈霉素購自華北制藥廠；鼠抗兔平滑肌α肌動蛋白單克隆抗體，購自Zymed公司；SP免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑盒購自北京中山生物技術公司。
1.2 細胞培養 斷頸處死小鼠，75%乙醇浸泡消毒2min，分離取出胸主動脈，D-Hanks液清洗去除血污，獲干凈光滑的血管段，用眼科鑷固定血管段端，刀片輕刮去外膜結締組織，再用眼科剪小心剖開血管，刮去內膜層細胞，將血管段剪成1mm×1mm大小的組織塊，均勻貼放于25ml培養瓶底面，組織塊間隙約2~3mm，加入含10%胎牛血清的1640培養液2~3ml，輕晃培養瓶使培養液掠過組織塊，翻轉靜置于37℃、5%CO2培養箱中3~4h，再次翻轉培養瓶使組織塊浸沒于培養液中，半開放式絕對靜置培養3d，4~5d時首次換液。當組織塊周圍外長的細胞相互匯合，逐漸鋪滿整個瓶底時，需進行首次傳代：吸棄舊培養液，D-Hanks液2ml清洗后吸棄，加0.25%（g/L）胰酶液2ml在37℃下消化，2~5min后鏡下觀察，當細胞回縮、間隙增大時，吸棄胰酶液，加入含10%胎牛血清的1640培養液4~6ml終止消化，反復吹打瓶壁細胞，形成的細胞懸液按1∶2接種（消化后脫落的組織塊可一并傳入新培養瓶中）。以后的傳代方法相同，傳代周期為5~7d。
1.3 細胞純化
1.3.1 自然純化法 由于進行了前期的血管預處理（去除了大部分內膜和外膜組織），原代培養時雖為多種細胞混雜生長，但平滑肌細胞仍占絕大多數。隨著傳代次數的增加，平滑肌細胞可排擠其它細胞的生長而優勢增殖。
1.3.2 機械刮除法 雖然去除了大部分內膜組織，但培養中仍可見內皮細胞的小范圍生長。傳代前在鏡下用記號筆在培養瓶表面劃出內皮細胞生長區域，用彎頭吸管在該區域內反復推刮、破壞細胞，吸棄培養液后再進行傳代。
1.3.3 差異貼壁法 殘留的內膜和外膜組織中含有少量的成纖維細胞，參閱李悅梅等[1]的方法去除：傳代時，將消化吹打形成的細胞懸液靜置15min，使部分細胞貼壁，轉移培養液至下一個培養瓶中，再次靜置、貼壁，重復上述步驟1~2次，最后一個培養瓶中可獲較純的平滑肌細胞。（根據不同細胞貼壁的時間差純化細胞）
1.4 細胞鑒定
1.4.1 形態學觀察 應用倒置相差顯微鏡觀察細胞大小、形態、生長特點及排列方式等。
1.4.2 免疫細胞化學染色 將第5代對數生長期的細胞懸液接種到預先放置2張7mm×22mm蓋玻片的培養瓶中，培養2~3d后，取出蓋玻片，PBS漂洗5min×3次，4%多聚甲醛室溫下固定20~30min，PBS再次漂洗5min×3次，然后按照SP免疫組化試劑盒和DAB顯色試劑盒說明書逐條進行操作（一抗是鼠抗兔平滑肌α肌動蛋白單克隆抗體）。
細胞培養的幾點技巧：①相同條件下，小齡動物較大齡動物的組織塊有更好的增殖潛能，但動物體積過小又存在取材困難，組織量少的問題，采用9~12 d新生小鼠取材，既能對血管進行順利操作，又能保證約90%的組織塊有細胞外長。②細胞生長具有接觸抑制和密度依賴性，一般取2~3只小鼠的胸主動脈組織塊均勻接種于25 mL培養瓶中，間隙約2~3 mm。當部分組織塊周圍細胞密集、重疊，停止增殖時，即使整瓶細胞未達到傳代標準，仍可用酶消化，吹散密集細胞，1∶1方式傳代生長。③原代培養初期，當部分組織塊漂浮未貼壁，可將其重新擺放至瓶底，翻轉干涸2~3 h后，再浸沒于培養液中，使其重新貼壁。該法不會影響同瓶中其他已萌出細胞的生長。④小鼠主動脈極細，操作時動作一定要輕柔，避免對血管的過度損傷。一般受牽拉少，剪切時邊緣整齊圓滑的組織塊萌出細胞的概率較大。⑤細胞傳代時，酶消化時間不應固定或硬搬他人經驗，應在鏡下觀察，至胞質回縮，間隙增大時及時終止消化。
細胞原代培養的常用方法有酶消化法和組織塊法，酶消化法培養周期短，但酶作用時間不易掌握，且消化酶本身對培養細胞有毒性作用，可致培養失敗；組織塊法雖培養周期相對較長，但操作簡便，污染機會小，培養效率高。本研究中由于新生小鼠主動脈細小，可供培養的組織量少，于是采用了組織塊培養法。
07濱州醫學學報 改進的臍動脈血管平滑肌貼塊培養法
用DMEM培養液反復沖洗，以去掉血管內外的血跡，用眼科鑷小心分離下動脈外的結締組織及血管外膜，然后用眼科剪縱向剪開血管，再用眼科剪將中膜和內膜剪成約1~2 mm2大小的組織塊，用彎頭吸管將血管小塊移入25 cm2塑料培養瓶，并以4~7塊/cm2的密度均勻排列于培養瓶底（培養瓶底提前用培養液濕潤），翻轉后加入含有青霉素和鏈霉素及20%胎牛血清的DMEM培養液約3~5 m，l放入37℃、5%CO2培養箱內（濕度100% ），貼壁2~3 h后再輕輕翻轉培養瓶，使組織塊浸入到培養液中，開放式培養，一周后取出觀察并換液。
1.2.2 胎兒臍動脈血管平滑肌細胞的傳代培養：細胞生長融合后，用0.125%的胰蛋白酶消化傳代。先將胰蛋白酶放入37℃水浴箱預熱。用吸管將組織塊從培養瓶底輕輕吹打下來，可以將組織塊重新移入另一培養瓶繼續貼塊法培養。用無血清的培養液將培養瓶底沖洗兩遍，洗掉殘留的血清，然后迅速加入預熱的胰蛋白酶，放回培養箱，每隔2 min觀察一次，并輕輕拍打培養瓶壁，使細胞從瓶底脫落下來，待鏡下觀察多數細胞收縮變圓后，向培養瓶中加入含血清的培養液，終止胰蛋白酶的作用，再用吸管輕輕吹打培養瓶底，使細胞脫落，然后將培養瓶中的液體移入離心管，500 r/min，離心10 min后，棄上清液，然后加入含有10%胎牛血清的培養液將沉淀制成均勻的細胞懸液，按1∶2的比例將細胞懸液移入培養瓶，放回培養箱繼續培養。
1. 2.3 血管平滑肌細胞的鑒定
取常規傳代的細胞，制成均勻的細胞懸液后，移入放有蓋玻片的培養皿中培養，待細胞貼壁伸展，生長良好后取出蓋玻片，用PBS沖洗2遍，涼干，放入4%的多聚甲醛中固定，30% H2O21份+純甲醇50份混合，滅活內源性過氧化物酶，然后熱修復抗原，再分別滴加5%BSA封閉液、一抗[即抗平滑肌α-肌動蛋白（α-actin）的單克隆抗體]、生物素化山羊抗小鼠IgG、試劑SABC，最后DAB顯色，蘇木素復染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。