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D-木糖異構酶 葡萄糖異構酶 酶學實驗手冊 第三章
葡萄糖異構酶是應用最多的酶之一，本質上它是木糖異構酶而非葡萄糖異構酶。它從各種各樣的微生物中分離得來，它在微生物體內作為木糖代謝物。半纖維素，像木聚糖或阿拉伯糖，是最豐富的自然營養物質之一，包含了世界上大約 40％ 的生物量。它由木聚糖酶裂解，木聚糖酶是由生物體分泌到基質中的外泌酶，能使多聚結構分裂成單糖單位像木糖，單糖單位可被細胞重新吸收并被木糖異構酶轉化成木酮糖，木酮糖激酶通過激活 D-木酮糖-5-磷酸使木酮糖進入磷酸戊糖途徑。由于結構相似，葡萄糖可以被相同的酶異構成果糖，但效率比較低（轉化因子大約是 5，取決于微生物各自的酶）。這個酶是一個同源四聚體，單個亞基的相對分子質量約為 45 000，而天然酶則接近于 200 000，每個亞基都有兩個必要的二價金屬離子，一個與催化反應直接相關。另一個用來維持天然結構。Mn2＋ 是對木糖酶最有效用的離子，而對于葡萄糖反應有 Co2＋ 會更有活性。在失去催化活性時，金屬離子能可逆地與 EDTA 結合，這種酶相當穩定即使來源嗜溫菌的酶也能在 50℃ 進行測定。
來源：《酶學實驗手冊》
D-木糖異構酶測定
D-木糖異構酶微板分析
葡萄糖異構酶的測定實驗
葡萄糖異構酶微板測定
| 實驗方法原理 |
D-木糖 ? D-木酮糖 |
|---|---|
| 實驗材料 | 酶溶液 |
| 試劑、試劑盒 | TES NaOH D-木糖MnSO4 半胱氨酸·HCl 咔唑溶液 硫酸 |
| 儀器、耗材 | 分光光度計 |
| 實驗步驟 |
實驗所需「試劑」具體見「其他」
20 ul 的實驗混合物和 20 ul 酶溶液（各自用 20 ul TES 緩沖液作對照）混合，并在測定溫度（例 50℃）下緊靠反應容器放置 15 min，在用冰冷卻并加入 40 ul 半胱氨酸和 40 ul 咔唑溶液的情況下酶反應會停止，加入 1.2 ml 70％ 硫酸顏色開始變化，在室溫下放置 10 min 后對比參照，在 546 nm 處測吸光值。
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| 注意事項 |
過任何時間顏色也不會達到一個恒定量，因此，每隔 10 min 必須非常仔細地觀察顏色的變化，在同樣的時間間隔后所有的樣品都被準確讀數。空白對照的吸光值應該大約是 0.2，如果吸光值接近 0.3 則測定反應物需重新配制。為了定量，需要準備木酮糖的校對曲線，木酮糖濃度應在 0～10 umol/L 之間。
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| 其他 |
試劑： 0.2 mol/L TES/NaOH，pH 8.0［N-tris（羥甲基）-甲基-2-氨甲基酸，Mr＝229.3；9.2 g 溶于 100 ml 水中，用 1 mol/L NaOH 調節至 pH 8.0，用水加至 200 ml］ 0.4 mol/L D-木糖（Mr＝150.1；1.2 g 溶于 20 ml 水中） 0.03 mol/L MnSO4（單水化合物，Mr＝169.0；57 mg 溶于 10 ml 水中） 1.5％ 半胱氨酸·HCl（半胱氨酸·HCl-水合物，Mr＝175.6；溶解 1.5 g 在 100 ml 水中） 0.12％ 咔唑溶液（Mr＝167.2；120 mg 溶于 100 ml 乙醇中） 70％ 硫酸
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