Oligo DNA的人工化學合成始于50年代初期，1980年，全自動的固相DNA合成儀面市后，使得快速、高效合成Oligo DNA成為可能，這大大地推動了生物工程技術的蓬勃發展。
現在一般都采用β-乙腈亞磷酰胺化學合成Oligo DNA，將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的合成時從3' →5' 方向進行，通常3' 端的第一個堿基結合在Glass擔體 (Controlled Pore Glass，CPG)上。其具有高效、快速的偶聯以及起始反應物比較穩定的特點。
合成步驟
Step1：脫掉附加在CPG擔體上的第一個堿基5' -OH基團上的保護基 (DMTr)，準備附加下一個新的堿基；
Step2：活化新的堿基單體 (Phosphoramidite)，準備與第一個堿基進行反應；
Step3：第二個堿基與第一個堿基發生偶聯反應；
Step4：將沒有反應的第一個堿基的5' -OH加帽封死 (Capping)，使其不再進一步參與反應；
Step5：將核苷亞磷酸酯氧化成更穩定的核苷磷酸酯 (即將三價磷氧化成五價磷)。
Step6：重復進行Step1～Step5的循環，直至合成完所需的Oligo DNA序列。
Step7:合成結束后，將Oligo DNA分子從CPG上切下，再進行進一步的純化。
圖1 Oligo DNA合成原理。N1代表第一個堿基，N2代表第二個堿基，依此類推。
OD數的確定
一般PCR擴增，2 OD引物，可以做200-500次50ul標準PCR反應。如果是做基因拼接或退火后做連接，1 OD就足夠了。但是有些研究人員，就做幾次PCR，但是卻要5-10 OD。做全基因構建的引物都比較長，但是我們有些研究人員也要求高OD數。片段越長, 最后全長得率就越低，出錯的幾率就越大。超出需要之外的OD數要求，也是一種浪費。
引物純度檢測
實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600V電壓進行電泳，一定時間后(約2-3小時)，剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的。如果條件許可，也可以用EB 染色或銀染方式染色。
引物級別選擇
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