1)什么是引物延伸實驗？
引物延伸實驗用于定量mRNA的量，測定低豐度的mRNA的種類。另外引物延伸實驗可標定轉錄產物的5`-端， 確定轉錄的精確起始。特異的末端標記的引物退火到RNA鏈的互補區域， 隨后用RNA作為模板，用反轉錄酶延伸引物得到cDNA，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析cDNA。cDNA的長度為引物的標記的核苷酸到RNA-5`末端間的堿基數，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比。理想的引物是ssDNA, 長度為20-40個核苷酸，與要分析的轉錄產物的5`末端區域互補。延伸產物小于150個核苷酸，可得到最佳分離效果。引物延伸實驗非常靈敏，可檢測2pg的轉錄產物，這相當于1個細胞中的1個RNA。引物延伸實驗非常適合于對單個基因作定量和定性分析。
2)作這樣一個實驗必須用什么試劑？
引物延伸實驗需要模板RNA，可用總RNA或poly(A)+RNA。一個特異的末端標記的核苷酸或DNA片段作為引物，用反轉錄酶合成cDNA。除RNA模板和標記的引物，還需要反轉錄酶，AMV或MMLV反轉錄酶、反應溶液、脫氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝膠試劑，和電泳裝置。所得結果用放射自顯影和磷成像儀分析。
3)引物延伸系統中有些什么組分？
引物延伸系統中AMV反轉錄酶和反應溶液、焦磷酸鈉、正對照RNA模版和對照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標準分子參照物、T4多核苷酸激酶和溶液、樣品溶液、AMV 反轉錄酶 2X溶液 100mMTris-HCl（pH8.3, 42oC）、100mM KCl、 20mMMgCl2、20mMDTT、2mM每一種dNTP、1mM精胺。PhiX174標準分子參照物和T4 多核苷酸激酶用作引物標記，和確定延伸產物長度的標準。對照RNA可得到87個堿基的延伸產物作為正對照。參照技術手冊TB113查閱引物延伸系統和AMV反轉錄酶的其它信息。
4)反應中用焦磷酸鈉的目的是什么？
引物延伸反應中用焦磷酸鈉和精胺可增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產生發卡結構。雖然其作用方式未確定，但結果是增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產生發卡結構。MMLV被焦磷酸鈉和精胺抑制，如使用MMLV，放線菌素D可用于增加全長cDNA的得率，抑制模板RNA產生發卡結構。焦磷酸鈉和放線菌素D抑制cDNA第二條鏈的合成。
5)為成功進行引物延伸實驗需對哪些因素作優化？
引物延伸實驗中所用的雜交溫度是最關鍵的需優化的因素。一般而言，最高緊密度，或引物和互補序列完全雜交所需的最適條件是，低于引物溶解溫度的5oC。低于最高緊密度的溫度可極大地增加雜交速度。應在不同的緊密度的雜交溫度下作雜交，以控制引物和特異RNA的雜交。增加雜交緊密度時，帶來的延伸產物的丟失表明，引物和相關的卻不是等同的轉錄產物雜交。在堿和雙價陰離子的存在下，RNA在較高溫度會降解，應用甲酰胺雜交操作方案，這可有效降低溶解溫度，因此可使雜交在較低的溫度進行。可在雜交步驟中用以下的溶液：40mMPIPES、1mMEDTA、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺。如用這個雜交溶液，延伸步驟前甲酰胺和鹽需用乙醇沉淀后除去。
模板RNA和引物的量需優化。以下討論了所用RNA模板和引物的起始量。反轉錄酶對不同模板使用的效率不同。這部分是由于RNA中存在的次級結構干擾反轉錄酶的聚合酶活力。如產生短的產物，這通常不是一個問題。如用AMV反轉錄酶，延伸溫度可達55oC。
6)每次反應所用RNA的量是多少？
每次反應所用RNA和引物的量取決于分析的RNA的種類（總RNA或poly(A)+RNA）,目的RNA的相對豐度。如用總RNA，起始量為10ug，但分析稀有信號，每次反應用100 ugRNA。poly(A)+RNA每次反應用0.1-1.0 ug，具體決定于總RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特異RNA的濃度。在引物延伸分析前需檢查目的RNA的完整。通過凝膠分析總RNA，應有完整的18S和28S核糖體RNA帶。在引物延伸反應中用Northern印跡和RT-PCR分析來確定特定RNA的存在。
7)每次反應所用引物的量是多少？
用引物延伸實驗定量RNA，標記的引物必須多于目的RNA。引物應是互補RNA的5-10倍。但一般，總RNA或poly(A)+RNA中，特定目的RNA量未知。對未分析的轉錄物，初次分析用50 ug總RNA和100fmol引物。如所有RNA中與引物互補的位點飽和，測試信號和投入的RNA的量成正比，而不依賴于引物的濃度。引物應至少為20個核苷酸，雜交位點應位于轉錄產物5`-末端下游的100個堿基處，而不會自互補。也可用從限制性酶切片段所得的ssDNA作為探針，長度應不長于50-100個核苷酸，以獲得最佳分辨率。
8)用AMV和MMLV各有哪些優點和缺點？
引物延伸反應通常用AMV，AMV性能更好，對次級結構耐受。用AMV的延伸溫度可達55oC, 以消除次級結構，但在這樣溫度下，引物延伸反應的得率通常降低。MMLV的最適溫度為37 oC，在更高溫度下，MMLV不穩定，但MMLV可合成更長的產物，這一特點對引物延伸反應不適用，因引物延伸反應所得的產物一般較短，為100-500個核苷酸。
9)有哪些因子會導致非特異，短的和多個引物延伸產物？
所研究的轉錄的差異程度可導致產生不同長度的延伸產物，它們來源于選擇式剪切和使用不同的轉錄起始位點。差異核RNA的存在也能導致產生多個延伸產物。引物和RNA中相關或無關序列的交叉雜交也會導致非特異延伸產物的產生。產物短于預測可能和RNA模板的降解有關，或者是轉錄產物中次級結構阻制了反轉錄酶的合成，產生斷缺的cDNA。RNA樣品中存在DNA污染同樣可得延伸產物，加放線菌素D（75ug/ml）可抑制這類產物的產生。應作無RNA模板的負對照實驗，以確定所用試劑中無RNA和DNA污染。同時還應用從不表達目的轉錄產物的細胞或組織中提取的RNA模板作負對照實驗。
10)如何計算RNA轉化為cDNA的量？
RNA轉化為cDNA的量可對引物延伸產物，和`無RNA`對照實驗的cpm作測量得到。從凝膠中分別切割引物延伸產物和`無RNA`對照實驗中產物，在閃爍液中測定凝膠塊的讀數，可有效平衡聚丙烯酰胺凝膠的湮滅和32P的衰退。
以下的例子表明如何計算fmol的RNA轉化為cDNA，在這個例子中，一半的引物延伸產物（20ul/40ul）加入凝膠中作分析。`無RNA`對照實驗的引物濃度為100 fmol，一半的反應液加入凝膠中作分析。切割的帶的讀數為：
樣品為3912 cpm
引物為142359 cpm
首先計算引物cpm/ fmol：cpm/ fmol=142359 cpm/[100 fmolX（20/40）]=2847 cpm/ fmol
接下來計算引物延伸產物的fmol，或cDNA：3912 cpm/[2847 fmolX（20/40）]=2.75 fmol cDNA。所得值表明引物延伸中所得的cDNA的量。
11)用什么分子標準參照物確定引物延伸產物的精確長度？
為確定引物延伸產物的精確長度，應同同位素標記的DNA分子標準參照物對照。DNA分子標準參照物末端作了標記，上變性凝膠前先作變性，引物延伸產物也作變性。長度在20-500核苷酸范圍的分子標準參照物在確定引物延伸產物的長度方面很有用。去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標準分子參照物非常方便，已去磷酸，可作5`末端標記，分子標準參照物的長度為24-726核苷酸。
12)能用測序膠分離引物延伸產物嗎？
用于引物延伸產物分離的聚丙烯凝膠的規格為16X18cm, 含8%聚丙烯、7M尿素、1′TBE溶液。這種膠和測序膠很相似，故一般可用測序膠。應注意不使引物延伸產物和自由引物跑到膠外，特別是需對cDNA定量時。
有關文獻：
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1. Boorstein WR and Craig EA (1989) Meth Enzymol 180, 347
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4. Freeman W M, Vrana SL, and Vrana KE (1996) Biotechniques 20, 782
