引物溶解引物保存

1.  如何測定引物的OD值？

用紫外分光光度計在260nm波長測定溶液的吸光度來定量，請注意紫外分光光度計的使用，測定時溶液的吸光度最好稀釋到0.2~0.8之間（吸光度太高或太低會有較大的誤差）。DNA干粉用一定體積的水充分振蕩溶解以后，取部分溶液稀釋到1 ml 并在1 ml 標準比色皿中測定其吸光度，即為所測體積的OD值，進而可以計算出母液的OD值。

舉例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取該母液50 μL 稀釋成1 ml 并在1 ml 標準比色杯中測定的吸光度為0.25，說明該50 μL中含有0.25OD的DNA，也即說明原來1ml母液中含有5OD的DNA。

2.  怎樣溶解引物？

生工的合成報告單給出了每OD引物稀釋為100 μmoL/L（即100 pmol/ul）濃度的加水量，您可以根椐您的實驗需要加入適量的無核酸酶的雙蒸水（PH>6.0）或TE緩沖液（PH7.5~8.0），開啟瓶蓋溶解之前最好在3000~4000轉/分鐘的轉速下離心1分鐘，防止開蓋時引物散失。

3.  合成的引物應如何保存？

沒有溶解的引物非常穩定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先稀釋為100 μmoL/L 的儲存液，分裝數份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以上（反復多次凍融會降低使用壽命）。使用前，將濃溶液稀釋成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后進行實驗。

注意：工作液千萬別用TE稀釋，要用DEPC水，或去離子水稀釋.因為TE可以鏊合鎂離子，鎂離子對Taq酶活性發揮至關重要，影響PCR反應。

4.  如何檢測引物的純度？

實驗室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定濃度的聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，<12個堿基的引物用20%的膠，12~60個堿基的引物用16%的膠，>60個堿基的引物用12%的膠，取0.2OD左右的引物，用尿素飽和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到飽和，上樣前加熱變性（95℃，2 min）。加入尿素的目的一是變性，二是增加樣品比重，容易加樣。600 V 電壓進行電泳，一定時間后（約2~3小時），剝膠，用熒光TLC板在紫外燈下檢測帶型，在主帶之下沒有雜帶，說明純度是好的（有時由于變性不充分，主帶之上可能會有條帶，乃是引物二級結構條帶）。

5.  一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基團嗎？

沒有，5'和3'末端均為-OH基。如需要加磷酸基團，訂貨時需特別注明。

6.  合成的引物進行PCR反應時無目的帶，怎么辦？

PCR反應失敗的原因很多，可以從以下幾個方面考慮。

（1）引物和模板是否配對，同源性有多大？

（2）引物本身是否有立體結構.

（3）PCR反應用試劑是否能正常工作？

（4）PCR儀是否工作正常？

（5）PCR反應條件是否合適？