引物設計原則（PrincipleofrealtimequantiationPCRprimer）

1、引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74°C，不適于Taq DNA聚合酶進行反應。

2、引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。引物3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。

3、引物3’端的末位堿基對Taq 酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發夾結構也可能導致PCR反應失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。

4、引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5、引物所對應模板位置序列的Tm值在72°C左右可使復性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)，在Oligo軟件中使用的是最臨近法（the nearest neighbor method)。

6、△G值是指DNA鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部堿基對的相對穩定性。應當選用3’端△G較低（絕對值不超過9），而5’端和中間△G值相對較高的引物。引物的3’端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構并引發DNA聚合反應。

7、引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過4.5Kcal/mol）易導致產生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

8、對應物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR引物的載體的相應序列而確定。

引物序列應該都寫成5-3方向的，Tm之間的差異最好控制在1度之內，另外我覺得擴增長度大一些比較好，500bp左右。

要設計引物首先要找到DNA序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。

① 引物應用核酸系列保守區內設計并具有特異性。

② 產物不能形成二級結構。

③ 產物長度一般在15～30堿基之間

④ G+C含量在40%～60%之間。

⑤ 堿基要隨機分布。

⑥ 引物自身不能有連續4個堿基的互補。

⑦ 引物之間不能有連續4個堿基的互補。

⑧ 引物5’端可以修飾

⑨ 引物3’端不可修飾。

　⑩ 引物3’端要避開密碼子的第3位。

1、 引物的特異性

引物與非特異擴增序列的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源。

2、 避開產物的二級結構區

某些引物無效的主要原因是引物重復區DNA二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關計算機軟件可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助于選擇模板。

實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小于58.6lkj/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。