簡介
PowerFecal? DNA Isolation kit 專門設計用于簡便快速糞便、腸內容物、生物固體樣品微生物和宿主總 DNA。基于 PowerSoil? DNA Isolation Kit 開發,使用了無論對土壤還是糞便樣品同樣奏效的ZL抑制因子去除技術(Inhibitor Removal Technology?)。IRT 技術能高效去除常見于糞便樣品的多糖、亞鐵血紅素和膽汁鹽等抑制因子。純凈的最終 DNA 可直接用于所有下游實驗。
操作預覽
糞便或生物固體建議加樣 0.25g。樣品裝入到含有石榴石研磨珠的獨立 2ml Bead Beating Tube 中。在研磨珠的機械碰撞和化學試劑對細胞膜的破解作用促使下宿主、微生物細胞裂解,高效的提取效果足以應付最難搞的微生物類型。ZL的抑制因子去除技術(Inhibitor Removal Technology?)接著去掉糞便樣品中常見的 PCR 抑制物。總基因組 DNA 吸附到硅膠濾膜上。經過沖洗和洗脫,純凈的最終 DNA 可直接用于 PCR、qPCR、第二代測序等進一步應用。
相關產品 | 貨號 | 提取次數 |
PowerMax? Soil DNA Isolation Kit | 12988-10 | 10 preps |
PowerSoil?-htp 96 Well Soil DNA Isolation Kit | 12955-4 | 4×96 preps |
12988-12 | 12×96 preps | |
PowerVac? Manifold | 11991 | 1 manifold |
PowerVac? Mini System | 11992 | 1 unit + 20 adapters |
PowerVac? Mini Spin Filter Adapters | 11992-10 | 10 adapters |
11992-20 | 20 adapters |
設備要求
微型離心機(13000g)
移液器(60μl – 750μl)
Vortex-Genie?2 渦旋儀(MO BIO 貨號#13111-V-220)渦旋儀適配器(MO BIO 貨號#13000-V1-24)
保存:組分室溫(15-30℃)保存。
試劑盒組分
貨號:12830-50
組分 | 量 |
Dry Bead Tubes | 50 |
Bead Solution | 42ml |
Solution C1 | 3.3ml |
Solution C2 | 14ml |
Solution C3 | 11ml |
Solution C4 | 72ml |
Solution C5 | 30ml |
Solution C6 | 6ml |
Spin Filters(units in 2ml Tubes) | 50 |
2 ml Collection Tubes | 200 |
△實驗前請先逐一檢查試劑!
保存:組分室溫(15-30℃)保存。
操作步驟
1、加入 0.25g 糞便或生物固體到 Dry Bead Tube 中。
注意:水分、多糖和蛋白含量較高的糞便樣品(如胎便、某些鳥類糞便)減少加樣量(0.1g)能提高 DNA 得率和純度。
2、加入 750μl Bead Solution 到 Dry Bead Tube 中。輕輕渦旋混勻。
這一步發生了什么:把樣品加入到 Bead Tube 后,下一步就是樣品均質化和細胞裂解。石榴石研磨珠和裂解裂解緩沖液可溶解和把樣品分散開。
3、使用前先檢查 C1 溶液。若有沉淀,60℃水浴直至全部溶解。
這一步發生了什么:C1 溶液含有 SDS。溫度較低時會在瓶底形成白色沉淀。60℃水浴可重新溶解 SDS,并且對SDS 和其它組分性能無損。可趁熱使用。
4、加入 60μl C1 溶液,上下顛倒數次或輕輕渦旋混勻。
這一步發生了什么:C1 溶液含有 SDS 和其它裂解試劑可輔助細胞裂解。SDS 是種去垢劑,可降解細胞膜上的脂肪酸和油脂。
5、65℃水浴加熱 10min。
這一步發生了什么:糞便樣品雜合了許多多糖、脂類、鹽和細胞等。加熱可加快裂解緩沖液與這些物質的反應速度,輔助裂解細胞。
6、把 Bead Tubes 水平放置到渦旋儀適配器上(MOBIO 貨號:13000-V1-24)。最大轉速連續渦旋振蕩 10min。
這一步發生了什么:研磨珠與微生物細胞在裂解試劑包圍下震蕩,可使細胞破裂。MOBIO 的渦旋儀適配器是個簡單而有效的附件,在渦旋振蕩過程中能把
Tube 管牢牢卡在渦旋儀上。你也可以用膠帶把 Tube 管固定在適配器上,但有可能在振蕩過程中松脫,影響樣品間條件一致性,降低得率。
7、13000g 離心 1min。
8、把上清轉移到一個干凈的 2ml Collection Tube(試劑盒提供)中。約可獲得 400-500μl 上清。
這一步發生了什么:這一步約可獲得 400-500μl 上清液。預期的體積與樣品起始量有關,不影響提取效率。
9、加入 250μl C2 溶液,輕輕渦旋混勻。4℃孵育 5min。
這一步發生了什么:C2 溶液為ZL的 Inhibitor Removal Technology?(IRT)的一部分。它含有可沉淀多糖、細胞碎片和蛋白質等非 DNA 的有機和無機物質的試劑。這些有機和無機物質會影響 DNA 純度并抑制下游實驗,必須去除。
10、13000g 離心 1min。
11、避開沉淀,最多只轉移 600μl 上清到一個干凈的 2ml Collection Tube(試劑盒提供)中。
這一步發生了什么:沉淀為多糖、細胞碎片、蛋白等非 DNA 有機和無機成分。為獲得最佳 DNA 得率和質量,轉移上清時避開沉淀。
12、加入 200μl C3 溶液,輕輕渦旋。4℃孵育 5min。13、13000g 離心 1min。
14、避開沉淀,轉移上清到一個干凈的 2ml Collection Tube(試劑盒提供)中。轉移的上清液不能超過 750μl。
這一步發生了什么:沉淀為多糖、細胞碎片、蛋白等非 DNA 有機和無機成分。為獲得最佳 DNA 得率和質量,轉移上清時避開沉淀。轉移的上清不能超過 750μl,否則會影響后續 DNA 的吸附綁定。
15、C4 溶液使用前先搖勻。加入 1200μl C4 溶液到上清中,渦旋 5s 混勻。
這一步發生了什么:C4 溶液為高濃度鹽溶液。可讓 DNA 牢牢地選擇性吸附到硅膠濾膜上,非 DNA 的有機和無機物質不被吸附,但仍會少量殘留在濾膜上。
16、加載 650μl 上清到一個 Spin Filter 中,13000g 離心 1min。棄去濾液,重復加載上清。
注意:一共需要加載 3 次上清。
高通量選項:一次要處理大量樣品時,步驟 16 會變得非常耗時。因此 MOBIO 開發出了真空泵抽吸法。需要額外購買真空泵適配器(MOBIO 貨號:11992)。平底 Spin filter 在真空泵適配器幫助下能快速完成濾過動作。
這一步發生了什么:DNA 在高濃度鹽環境下選擇性地吸附到離心柱硅膠濾膜上。雜質通過濾膜,剩下 DNA 留在濾膜上。
17、加入 500μl C5 溶液,13000g 離心 1min。
這一步發生了什么:C5 是含有酒精的沖洗緩沖液,可進一步沖洗離心柱硅膠濾膜上的 DNA。沖洗緩沖液還能去除硅濾膜上殘留的少量含和其它雜質。
18、棄去濾液。
這一步發生了什么:濾液不含 DNA。
19、13000g 再次離心 1min。
這一步發生了什么:再次離心去除殘留的 C5 溶液(含有酒精的沖洗緩沖液)。含有酒精的 C5 溶液必須全部去除掉,以免影響后續 PCR、消化、凝膠電泳等 DNA 應用。
20、小心把 Spin Filter 轉移到一個干凈的 2ml Collection Tube(試劑盒提供)中。避免沾到任何 C5 溶液。
21、加入 100μl C6 溶液到離心柱白色濾膜中心。你也可以用滅菌 DNA-Free PCR 級純水或 TE 緩沖液從硅膠離心柱上洗脫 DNA。
注意:用 100μl C6 溶液可獲得最佳的 DNA 得率。為了濃縮 DNA,C6 溶液使用量最少可以只加 50μl。C6 溶液用量少于 50μl 會嚴重影響洗脫效率。
這一步發生了什么:把 C6 溶液(滅菌洗脫緩沖液)加到離心柱白色濾膜中心,并潤濕整個濾膜才能獲得最佳洗脫效果。C6 溶液(洗脫緩沖液)通過濾膜,DNA 在高濃度鹽環境下選擇性吸附到濾膜上,在 C6 溶液(10mM Tris)低鹽環境下洗脫下來。
22、13000g 離心 1min,棄去 Spin Filter。此時 Tube 管中的 DNA 可直接用于下游實驗,無需進一步處理。DNA建議-20℃~-80℃冷凍保存。C6 溶液不含 EDTA。要濃縮 DNA,可參考下文疑難點。
感謝選用 PowerFecal? DNA Isolation Kit!
疑點難點
樣品處理量
本試劑盒設計每次提取 0.25g 糞便樣品。我們不推薦加樣超過 0.25g。含有大量蛋白質、脂類和多糖的某些糞便樣品,較少的加樣量(0.1g)可提高 DNA 得率和純度。
含水量較大的糞便樣品
若糞便樣品含有較多水分,可把樣品加入到 Bead tube 以后,10000g 離心 30s。抽掉所有游離水分。接著步驟 2 繼續。
若 DNA 擴增失敗
通過凝膠電泳和分光光度法同時檢測 DNA 得率。過濃的 DNA 模板會抑制 PCR 擴增。
使用 PowerFecal? DNA Isolation Kit 提取的 DNA 通常不需要稀釋模板 DNA,但也可一試。
若經過上述方法,DNA 仍擴增失敗,請檢查 PCR 反應體系(修改反應條件和重新選擇引物)。
可選裂解方法
為減少 DNA 斷裂: 加入 C1 溶液后,渦旋 3-4s,然后 70℃水浴 5min。渦旋 3-4s,再加熱 5min。渦旋 3-4s。此可選處理方法能減少 DNA 斷裂,但也會降低得率。
濃縮 DNA
最終 DNA 體積為 100μl。要濃縮 DNA 可加入 10μl 5M NaCl,上下顛倒 3-5 次混勻。然后加入 200μl 100%冷乙醇,上下顛倒 3-5 次混勻。室溫 10000g 離心 5s。棄去所有上清。用真空離心蒸發器、干燥器或冷干機除去殘余乙醇。用去離子水或滅菌 10mM Tirs 重懸 DNA。
DNA 保存
洗脫到 C6 溶液(10mM Tris)的 DNA 必須保存在-20℃~-80℃防止降解。為了延長保存時間,建議把 DNA 等分后-80℃保存。你也可以用 TE 緩沖液洗脫 DNA,而 EDTA 會抑制下游 PCR 等酶反應,不建議采用。