（3）GC來源的外泌體circSHKBP1在體外能促進GC細胞的增殖、遷移和侵襲
為了探索circSHKBP1是否影響GC細胞的生物學過程，分析了circSHKBP1在4種人GC細胞系（BGC823、HGC27、AGS和MGC803）和正常胃上皮細胞系GES1中的表達水平。結果表明，circSHKBP1在4個GC細胞系中均高表達。此外，來自BGC823細胞培養基的外泌體circSHKBP1在GC細胞系中也存在過表達。隨后，以circSHKBP1反向剪接序列的siRNA來敲低circSHKBP1，用pcDNA3.1-CMV-circRNA載體構建circSHKBP1過表達質粒。CCK8和EdU檢測和Transwell檢測顯示，沉默circSHKBP1顯
著抑
制GC細胞增殖、遷移和侵襲能力而過表達circSHKBP1則相反。此外，作者從轉染了circSHKBP1質粒的BGC823和HGC27細胞培養液中提取外泌體，與未處理的GC細胞共培養。結果表明，外泌體circSHKBP1的過表達也影響了GC細胞的增殖、遷移和侵襲。綜上所述，過circSHKBP1能促進GC細胞的增殖、遷移和侵襲并且隨著circSHKBP1在GC細胞中的表達，更多的circSHKBP1通過外泌體中干擾其他GC細胞的生物學功能。
（4）circSHKBP1可通過海綿機制吸附miR-582-3p
鑒于circRNA海綿吸附miRNA的作用已被廣 泛研究，且circSHKBP1在胞質中含量豐富，作者探索了circSHKBP1是否通過作為miRNA的海綿分子來發揮生物學功能。對BGC823細胞中的AGO2進行RIP，結果顯示內源性circSHKBP1特異性地富集于AGO2。使用CircInteractome預測可以與circSHKBP1結合的潛在miRNA分子（miR-582-3p、miR-665、miR-1207和miR-4458）。qPCR、RNA pull-down和雙熒光素酶報告實驗證實只有miR-582-3p可以直接與circSHKBP1互作。綜上所述，circSHKBP1可以充當miR-582-3p的海綿分子并降低miR-582-3p的表達。隨后作者將miR-582-3p單獨轉染或與circSHKBP1質粒共轉染到GC細胞中。CCK8和Transwell分析表明，miR-582-3p會抑
制GC細胞的增殖、遷移和侵襲，而過表達circSHKBP1則消除了它對GC細胞生長的抑
制作用，這表明circSHKBP1是通過海綿吸附miR-582-3p來發揮的促ai作用。
（5）circSHKBP1通過上調HUR來促進VEGF的翻譯
分析臨床數據發現circSHKBP1高表達組的血管浸潤率顯 著較高。使用生信分析網站找到了miR-582-3p的下游靶標HUR和EIF2S1，它們是VEGF（促進內皮細胞增殖）信號通路的一部分。WB分析顯示，過表達circSHKBP1會促進HUR和VEGF的表達，而對EIF2S1無影響。此外，miR-582-3p模擬物可以降低BGC823細胞中HUR和VEGF的表達。同樣，敲低circSHKBP1下調了HUR和VEGF，隨后導入miR-582-3p抑
制劑可以恢復HUR和VEGF的表達水平。HUR的RIP實驗證實，它可以與VEGF
mRNA和miR-582-3p直接結合。檢測GC組織中HUR
mRNA的表達水平，發現HUR表達與miR-582-3p表達呈負相關，與circSHKBP1表達呈正相關。結果表明，circSHKBP1可以通過調節HUR來調控VEGF的表達。
