彩色顯帶實驗

常規細胞遺傳學方法制備的染色體標本

RxFISH 探針 甲酰胺 乙醇 甲醇 冰乙酸 SSC HCl Tween-20 兔抗 FITC 抗體 DAPI

染色缸 濕盒 橡皮泥 相差顯微鏡 水浴鍋 烤箱 微量移液槍 微型離心機 離心管 冰箱 RxFISH Cyto Vision 系統 熒光顯微鏡 冷CCD攝像機

一、標本制備和老化

1.用甲醇/冰乙酸固定的方法制備細胞懸液。

2.滴一滴細胞懸液于載玻片上，在染色體鋪展所需的適宜溫度（25°C) 和濕度（45%?50%) 條件下干燥標本。

3.用相差顯微鏡檢測標本片的質量，在玻片上畫出染色體分散良好或感興趣的中期染色體區域。

4.在 60°C 烤箱中放置 2 h，老化當天制備的標本；或在 60°C 烤箱中烤 1h 老化室溫過夜的片齡 1d 的標本片。將老化后的標本置于室溫下，以備進行 RxFISH 的后續步驟。

5.標本在室溫下的 70%、85% 和 100% 系列乙醇中各脫水 2 min，空氣干燥。

二、變性和雜交用溶液的配制

1.配制 70% 乙醇，放于一 20°C 冰箱中。

2.配制 50 mL70% 甲酰胺/2XSSC(pH7.5) 放在 72°C 水浴鍋中。

3.配制 70%、85% 和 100% 乙醇，室溫保存。

4.準備濕盒，37°C 預熱。

三、探針變性

1.將裝有 RxFISH 探針的離心管在 37°C 水浴中預熱 5 min。

2.輕輕混勻，稍離心。

3.用無菌槍頭按每張標本 IOyL 的探針量移液到 0.5 mL 離心管，蓋好管蓋。

4.將不用的 RxFISH 探針放回一 20°C。

5.65°C 水浴中變性 RxFISH 探針 lOmin。

6.將變性過的探針于 37°C 水浴中放置 IOmin?2 h 備用。

四、標本變性

1.確保染色缸內的 70% 甲酰胺/2XSSC 溶液溫度為理想的 72°C(見注釋 1 和 2)。

2.在 70% 甲酰胺/2XSSC 溶液中變性標本（不超過 4 張）1.5 min(見注釋 3)。

3.迅速將變性標本于一 20°C 冰冷的 70% 乙醇中淬滅（見注釋 4)。

4.將標本依次在室溫條件下的 70%、85% 和 100% 系列乙醇中各脫水 2 min，空氣干燥。

五、雜交

1.降低環境亮度，避免 RxFISH 探針光漂白（見注釋 5)。

2.取 10uL 變性探針混合物加在標本片上畫出的雜交區域（含有分散良好的染色體或感興趣的中期分裂相）。

3.緩慢蓋上 25 mmX25 mm 蓋玻片，避免產生氣泡。

4.讓探針溶液鋪展到蓋玻片的邊緣，輕扣蓋片，在不移動蓋片的情況下排除氣泡。

5.用橡皮泥封片。

6.37°C 濕盒中孵育 48 h(見注釋 6)。

六、配制雜交后步驟所需溶液

1.配制 150 mL2XSSC 溶液（pH7.0)，分裝在 3 個染色缸中，放在 45°C 水浴鍋中（見注釋 7)。

2.配制 IOOmL50% 甲酰胺/0.5XSSC 溶液（pH7.0)，分裝在 2 個染色缸中，放在 45°C 水浴鍋中。

3.分裝 50 mLpH7.5 的 4：XTween 溶液（500 mL4XSSC 和 0.25 mLTween-20 儲存液）在 1 個染色缸中，放在 45°C 水浴鍋中。

七、雜交后洗脫

1.用鑷子小心除去橡皮泥，將標本放入第一缸的 2XSSC 中 45°C 孵育 5 min，滑落蓋玻片（見注釋 8~10)。

2.在 50% 甲酰胺/0.5XSSC 溶液中洗片 5 min，將標本轉到下一缸同樣溶液中，重復洗片 5 min。

3.在 2\83(^溶液中洗標本 51^11，將標本轉到下一缸 2\38(：溶液中洗 5 min04. 將標本轉到 4XTween 溶液中，45°C 孵育 IOmin。

八、抗體檢測步驟（可選擇的）

1.在上述的 3.7 中的第二次甲酰胺洗片的同時，室溫條件下 14OOOg 離心兩種檢測 FITC 的抗體 lOmin，只用上清進行下面的實驗。

2.在小離心管中加入 1ul 兔抗 FITC 抗體和 199uL 4 X Tween 溶液，輕輕混勻稀釋液。室溫避光孵育 10 min。

3.甩去標本上的多余液體。

4.向每張標本片加 200ul 兔抗 FITC 抗體 1:200 稀釋液，37℃濕盒中孵育 30 min。

5.將水浴鍋溫度由 45°C 降至 42°C，預熱裝有 4XTween 溶液的 50 mL 染色缸，同時預熱 6 次洗脫所需的 250 mL45XTween 溶液。

6.檢查以確保水浴鍋和 4XTween 溶液溫度為 42°C。然后移去標本上的蓋片，洗片 5 min。倒掉溶液，加入新鮮預熱的 4XTween 溶液，再洗片 5 min。重復一次該步實驗。

7.在洗脫的過程中，向另一離心管中加入 2uL FITC 標記的山羊抗兔 IgG 抗體和 198juL4XTween 溶液，輕輕混勻稀釋液。室溫避光孵育 lOmin。

8.甩去標本上的多余液體。

9.向每張標本上加 20(^LFITC 標記的山羊抗兔 IgG 抗體 1:100 稀釋液，37°C 濕盒中孵育 30 min。

10.檢查水浴鍋和 4XTween 溶液溫度為 42°C，然后洗片 3 次，每次 5 min。

九、DAPI 復染

將 10UL 復染劑和抗淬滅劑溶液加到標本上，并用蓋玻片（22 mmX22 mm) 封片（見注釋 11)。

十、圖像捕獲和分析

1.打開計算機，在研究菜單下選擇 RxFISH 軟件。打開軟件后，選擇捕獲界面。開始圖像捕獲前，將濾色塊輪設定到適合的順序。捕獲的探針信號保存在原始圖像圖層中，組合得到最終圖像。Rx_Cy5 信號最先捕獲，隨后依次是 Rx-Cy3、Rx-FITC 和 Rx-DAPI。

2.用 FITC 進行中期掃描。FITC 熒光信號不容易淬滅，所有的分析過程可以保持明亮。當找到一個中期后，在 100X 油鏡頭下聚焦，然后選擇 Rx-Cy5。

3.肉眼無法觀察到 Rx-Cy5, 需要依賴計算機圖像來了解詳細信息。當曝光設定為 5s 時，應能夠在黑暗背景下檢測到微弱的白色圖像。緩慢聚焦增加清晰度，因為在照相機和軟件之間存在時間延遲。調節明暗直至得到好的對比度（約 90% 準確度）。針對不同的圖像設置應略微調整。

4.點擊「Live」按鈕，濾色塊輪將自動轉到列表中的下一個熒光濾色塊。大多數情況下其他的熒光信號曝光 2s 即可。一旦得到清晰帶型的圖像時，點擊「Capture」按鈕。

5.完成所有 4 個突光信號的捕獲后，選擇標記有「RxFISH Image Capture」的界面。在選擇的界面內，完成整套圖像的合成。保存所有的圖像，即使有提示也不要刪除，這些圖像在分析中非常有用。

6.激活「Analysis」菜單，選擇你想要分析的細胞。選擇「Loadcell」將顯示多色顯帶的染色體（見注釋 12)。在「AnalysisCustomize」菜單下，RxFISH 圖像也可顯示為 DAPI 反轉圖像，可幫助識別染色體。「AnalysisProfile」工具用于顯示每條染色體強度曲線。

7.用「Analysis」命令可分開染色體，只要一完成染色體分離，就可用「Classifier」和「Auto」命令產生細胞的核型。

注釋

1.變性步驟是操作程序中非常關鍵的。變性時間和溫度由標本的類型和片齡決定。每個實驗者應根據自己需要確定適宜的溫度和時間。一般在 70~75°C 溫度范圍和 1.5?2 min 時間范圍內能夠得到好的結果。

2.整個實驗過程中，應在使用前檢查每個染色缸中的液體溫度。通常染色缸中的液體溫度比水浴鍋的溫度至少低 TC。

3.每張室溫標本放入 72℃甲酰胺中將降低 70% 甲酰胺/2 X SSC的溶液溫度 0.5~1°C; 如果一次放人超過 4 張標本，70% 甲酰胺/2XSSC 的溫度將不足以進行變性。

4.如果處理超過 4 張標本片，70% 甲酰胺/2XSSC 和第一缸 70% 乙醇必須調回它們的初始溫度，即分別為 72°C 和一 20°C。

5.Cy5 熒光染料在紅外波長范圍內非常敏感，易被白光激發，因此在圖像捕獲過程中，應首先進行捕獲，因為它將第一個淬滅掉的熒光。

6.標本在 37°C 濕盒中雜交 12~96 h。探針雜交時間不要少于 12 h，因為這會使信號強度將大大降低。雜交 48 h 能夠得到穩定的強信號，這是成功捕獲圖像所必需的。可根據各實驗室的經驗減少雜交時間。

7.為確保結果的質量，每天倒掉使用過的溶液。變性步驟中用的溶液不能儲存起來用于雜交后洗脫步驟。

8.雜交后洗脫的步驟應在弱光的條件下完成，避免直接標記突光染料（Cy5 和 Cy3) 光漂白。

9.在雜交后的所有實驗步驟中，標本片不能干掉。

10.如果蓋片不能從載片上滑下來，將標本片放于 2XSSC 中再次洗脫 5 min，再檢查蓋片是否滑落。

11.標本片在一 20°C 避光保存，以備拍照。

12.如果染色體彩色帶型顏色比較淡，不夠明亮，在比較暗的設置下（減少曝光時間）重新捕捉圖像。在圖像捕捉前調好焦距，縮短曝光時間以減少延遲。

照相機有個芯片收集熒光，然后將信息傳遞到計算機中，這就是為什么出現延遲的原因。DAPI 圖像不應該太暗，它為其他熒光顏色提供背景。如果 DAPI 圖像不夠亮，染色體看起來邊緣參差不齊。由于同樣的原因，調節好 DAPI 圖像的焦距是很有必要的