循環腫瘤細胞檢測如何實現即時個體化醫療？

　　惡性腫瘤的高度異質性使不同個體之間存在藥效的差異，給臨床診治造成了很大困擾。人類基因組學、藥物基因組學與腫瘤生物學研究成果的涌現，推動了腫瘤個體化醫療模式的興起與快速發展。它提倡先檢測與藥效相關的基因或生物標志物，實現對腫瘤的分子分型，從而選擇適合特定個體的藥物，提高藥物療效及降低不良反應。目前，臨床上一般通過手術切除或穿刺活檢得到腫瘤組織來進行分子分型，創傷性大，取材的次數受限。

　　 外周血中的循環腫瘤細胞(circulating tumor cells，CTCs)是指由實體瘤或轉移灶釋放進入外周血循環的腫瘤細胞，可作為腫瘤代表性的“液體活檢”樣本，允許非侵入性、多次、實時獲取。CTCs的監測在腫瘤的實時個體化治療中具有獨特的優勢。

　　 一、循環腫瘤細胞的檢測方法

　　 1．分離方法：

　　 分離是將CTCs與血細胞分開并富集的過程。伴隨著現代科技的發展，根據CTCs的生物學特性及其體積、密度、電荷和變形性等物理特征，已有多種技術應用于CTCs的分離。其中，基于生物學特性的方法主要是運用免疫學原理，利用CD45、CDl4等白細胞特異性表面抗原來去除白細胞(負性分選)或用上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)、人表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor·2，HER-2)等抗體進行細胞富集(正性分選)。Ce|lSearch系統是一個經典的正性分選方法，其原理是先用EpCAM抗體標識的微磁珠從全血中捕獲細胞，然后用免疫熒光識別EpCAM CK CD45一DAPI 細胞(被定義為CTC)來進行磁性分離。正性分選的CTCs純度高，但目前分選方法大多基于上皮標志物，CTCs可能因上皮一聞質轉化(epithelial—mesenchymaltransition，EMT)丟失這些分子，導致具有間質表型的CTCs無法被富集；而且有些非上皮來源腫瘤、抗原表達減弱、被血小板包被等腫瘤細胞易漏檢；良性上皮循環細胞會引起假陽性。由于CTCs表面抗原性質的復雜性，制約了基于抗原的分離方法的效果。

　　 目前，非抗原依賴性的分離方法受到了關注。密度梯度離心是根據各種細胞密度不同來進行離心分層，但不能有效區分CTCs與單個核細胞。膜過濾法是利用上皮腫瘤細胞體積比白細胞大的特點來分離，對細胞損傷少，能保持細胞的形態與活性用于后續的細胞培養與分型鑒定，也能進行化療或放療敏感性分析；但部分白細胞會在膜上殘留，部分小CTCs易丟失。介電電泳分選是在微流控芯片外加一個不均一的電場，對介電特性不同的細胞進行遷移分離，特異性高，能較好的保持細胞的活性。

　　 CTCs在血中含量稀少，只有1．43％的進展期乳腺癌患者含蘭500個CTCs／7．5 ml血液。其有效分離是后續分析與準確檢測的關鍵前提，也是目前關注的焦點。為了充分發揮不同分離技術的優勢，提高方法的敏感性和特異性，實際的CTCs分離設備往往整合多種技術于一體。美國麻省總醫院研制了一種融合了微流控分離芯片、磁電泳與白細胞去除等技術的非抗原依賴的CTCs分離裝置，消除了EMT表型變化的困擾，提高了分離速度、效率與收獲腫瘤細胞的純度，而且能保持細胞的形態與性質，便于后續的分型分析。

　　 2．分析方法：

　　 對分離出來的CTCs可進行基因型、表型分析與功能鑒定。FISH技術可用于檢測CTCs的基因擴增(如HER．2)與基因重排(如ALK)的情況等，RT—PCR和芯片方法用于檢測腫瘤細胞中高表達的mRNA(如CKl8、CKl9、PSA、MUCl)或突變性質的基因(如KRAS、EGFR、PIK3CA)，從而反應CTCs的數量、活力以及功能；單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術，目前已被用于分析CTCs的基因突變與基因組異常分析等。CTCs的表型分析主要通過利用免疫熒光方法檢測CK8／18／19、CD45、DAPI、HER一2等標志物來進行。上皮免疫斑點法通過檢測細胞在短時間培養中分泌、脫落或釋放的蛋白質，對有功能活性的CTCs進行評估。

　　 二、循環腫瘤細胞監測在腫瘤實時個體化醫療中的臨床應用

　　 1．預后預測：

　　 CTCs在健康人和良性疾病患者血液中幾乎檢測不到，在腫瘤早期的患者血液中含量極低，但在腫瘤進展到晚期后其計算顯著升高。治療前血液中CTCs的基線水平，已被認為是轉移性乳腺癌、結腸癌和前列腺癌患者的一種可靠的獨立預后指標。與外周血<5個CTCs／7．5 ml的乳腺癌患者相比，治療前血液中至5個CTCs的患者的無進展存活時間與總生存時間均顯著縮短。而且CTCs也能早期預測肺癌、胃癌等患者的預后與化療效果。但CTCs在患者預后預測的臨床應用依賴于檢測方法的完善及預測標準的建立。

　　 2．個體化藥物選擇：

　　 CTCs具有與腫瘤原發灶相似的基因型和表型。目前，國際上越來越側重于研究CTCs的分子分型對靶向藥物治療的指導價值，從而擺脫目前單純依靠腫瘤組織診治的窘境。HER．2單抗赫塞汀(Herceptin)對HER一2陽性的乳腺癌具有顯著療效。研究顯示，大部分乳腺癌CTCs的HER一2表達與原發腫瘤組織一致，這意味著可依據CTCs來指導乳腺癌靶向藥物Herceptin的治療。而且CTCs的雌激素受體和孕激素受體檢測也能指導乳腺癌的內分泌治療。腫瘤EGFR的突變被證實是酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼)等靶向藥物對非小細胞肺癌患者療效的預測指標。研究發現，非小細胞肺癌患者CTCs的EGFR突變情況與腫瘤組織也具有高度一致性。檢測患者外周血CTCs的EGFR突變情況可預測患者對酪氨酸激酶抑制劑的臨床療效，避免耐藥性的產生。

　　 腫瘤細胞的進化可使轉移灶表型與原發灶產生差別，而且CTCs的藥物靶向標志物也有時與原發灶不一致。HER-2陽性的乳腺癌患者經抗HER．2藥物治療后，CTCs為HER-2陽性的患者的無進展生存期比CTCs為HER．2陰性的患者要長。小部分原發乳腺癌組織為HER一2陰性的患者，在治療過程中檢測到CTCs的HER-2轉為陽性，在使用Herceptin治療后，也取得了較好的療效。這說明在實時個體化治療中，直接檢測CTCs藥物靶標的表達來指導藥物治療方案制定甚至優于檢測原發腫瘤組織，更能反映具有轉移潛質的腫瘤細胞特征。

　　 3.實時藥物療效評估：

　　 轉移性乳腺癌、結腸癌和前列腺癌患者經抗癌治療有效后，CTCs計數常由高降低。而CTCs計數經治療后從低升高，常預示腫瘤患者療效欠佳，病情惡化，生存期減短。比較腫瘤患者治療前后的CTCs計數變化，能反饋患者的療效情況，從而制定更明確的治療方案。

　　 EMT可使CTCs獲得干細胞特性，而具有藥物耐受性和高侵襲性。據一項研究報道，侵襲性強的乳腺癌類型的患者血液標本中，以間質性表型CTCs為主；在接受治療后，產生療效的患者的CTCs數量與／或間質型比例明顯下降，而病情惡化的患者的間質型CTCs計數明顯增多。在對指定患者治療過程中CTCs動態監測中，腫瘤患者初始對相應靶向藥物療效較好，CTCs數量明顯降低并以上皮型為主；經7個月治療后出現了耐藥性及病情進展，間質型CTCs升高；然后更換治療方案為標準化療，患者病情好轉，CTCs數目再次降低并以上皮型為主；3個月后，患者病情再次惡化，CTCs以間質型為主。這說明患者CTCs數量、EMT表型與藥物療效或耐藥情況密切相關。因此，腫瘤治療過程中實時監測CTCs的數量和相關分子標志物、EMT表型等分子特征，能有效反映患者的藥效動態信息及疾病狀況，從而有效地指導患者的個體化治療。

　　 三、展望

　　 目前，CellSearch系統是惟一經FDA批準進入臨床應用的CTCs檢測方案。但外周血中CTCs的含量稀少、異質性、CTCs細胞團在微小毛細血管中的滯留等因素，給其有效分離與準確檢測造成了極大的困難。現行的CTCs的分離方法大多基于上皮抗原，這些上皮抗原在EMT表型改變和一些侵襲性強的腫瘤細胞表面常發生丟失或減弱，而被漏檢。建立捕獲這些與腫瘤轉移相關的細胞亞群的有效方法，非常必要。而且絕大多數的分離方法不能獲得有活性的CTCs，用于后續的轉移潛能、侵襲性和藥物敏感性等生物學功能分析。現有的分離與檢測方法的這些局限性，嚴重制約了CTCs在臨床治療中的應用，迫切需要進一步的改進與完善。

　　 令人慶幸的是，目前越來越多的高新技術逐漸滲透于CTCs的分離與分析，使新研發的方法與設備功能更強，性能與檢測效果更好。單細胞全基因測序技術及單細胞基因組學可解決血液CTCs數量稀少的難題，能檢測更多藥效相關基因及分析耐藥機制，為CTCs的分子分型及靶向藥物治療提供更準確的信息。相信未來CTCs檢測技術的逐步改善與規范，將會給腫瘤患者帶來更大的希望。