微衛星不穩定性（MSI）檢測概述

　　一、微衛星不穩定性（MSI）簡介
　　微衛星不穩定性（Microsatellite Instability，MSI），是指由于在DNA復制時插入或缺失突變引起的微衛星（Microsatellite, MS）序列長度改變的現象，常由錯配修復功能（Mismatch repair, MMR）缺陷引起。MS序列，是一些短而重復的DNA序列，一般由1～6個核苷酸組成，串聯重復排列，常見類型為雙堿基CA/GA/GT或單堿基A/T等。MS序列可以位于基因的重要非編碼區，也可以位于基因的編碼區，多態性分布于整個基因組，個體差異大。
　　MSI現象于1993年被Jacobs等人在結直腸癌中首次發現。隨著針對MSI的研究深入，發現MSI現象不止存在于結直腸癌，在子宮內膜癌、胃癌、肝細胞癌、乳腺癌等實體瘤中均有發生。
　　二、MSI檢測方法
　　目前檢測癌細胞中的MSI時，既可以通過檢測MMR基因缺失來確定是否發生MSI，如依賴于免疫組化技術的蛋白水平檢測，也可以直接檢測MSI的序列變化，如PCR（聚合酶鏈反應）檢測等的分子水平檢測。
　　（一）免疫組化方法（Immunohistochemistry, IHC）
　　常見的方法為采用免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中錯配修復基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達。任何一項錯配修復基因表達缺失，被定義為MSI，否則即為微衛星穩定（MSS）。其中一個表達缺失則稱為低度微衛星不穩定(MSI-L)，2種或2種以上蛋白表達缺失為高度微衛星不穩定(MSI-H)。
　　此方法檢測MSI相對較簡單，成本較低。但存在一些問題，如使用抗體的不一致、病理醫生的閱片標準不一致等。
　　（二）分子水平的檢測
　　1.聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR)技術
　　目前主要采用多重熒光PCR結合毛細管電泳的方法。通過PCR方法檢測特異的微衛星重復序列擴增判定MSI狀態，比較腫瘤患者的標本組織與正常組織的位點突變情況。其比較的位點為美國國家癌癥研究所（NCI）推薦的5個微衛星位點：BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250。其中≥2個位點發生改變判定為高度微衛星不穩定（MSI-H），僅1個位點發生改變判定為低度微衛星不穩定（MSI-L），無位點改變判定為微衛星穩定（MSS）。有研究認為，二核苷酸重復序列的特異性和靈敏度比單核苷酸重復序列要低，因此關于最適合MSI檢測的位點仍存在爭議。Bacher等對266個微衛星位點(其中包括單核苷酸、二核苷酸、四核苷酸以及五核苷酸微衛星位點)檢測的敏感性及準確性進行評估，提出了Promega分析系統，該系統使用五個單核苷酸微衛星位點(BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24和MONO-27)及兩個五核苷酸微衛星位點(Penta C和Penta D)檢測MSI。
　　大量的實驗證實，MMR免疫組化檢測結果與MS的PCR檢測結果有高度關聯性，靈敏度92%，特異性可達100%。
　　該方法目前是檢測MSI的方法學“金標準”，但操作過程復雜，花費較高，且在結果判斷中會碰到以下問題，如熒光的過強或過少、非特異性峰、不顯著的峰大小改變，雜合性缺失等。
　　2.新一代測序方法（Next Generation Sequencing, NGS）
　　NGS又稱為第二代測序技術，是一種高通量測序技術，能一次性對幾十萬到幾百萬條基因分子進行序列測定。目前NGS方法已經成為檢測MSI的新工具，其最大優勢是可以實現多位點高通量檢測。紀念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，MSK）的一項研究使用NGS方法對12,288例實體瘤病人進行檢測，判定MSI狀態，并用MSI-PCR/MMR-IHC進行了驗證。實驗證明, NGS方法較MSI-PCR方法具有更高的敏感性。
　　三、MSI檢測的臨床意義
　　目前，有關MSI檢測的臨床意義有如下觀點：
　　（一）Lynch綜合征的篩查
　　Lynch綜合征，亦稱遺傳非息肉病性結直腸癌（HNPCC），是一種呈家族遺傳傾向的常染色體顯性遺傳病，由于MMR基因發生胚系突變所致，約占所有結直腸癌（Colorectal carcinoma, CRC）3%～5%。Lynch綜合征最突出的特點之一是攜帶者本人或家族成員可發生CRC及其他多種Lynch相關腫瘤。MSI是Lynch綜合征的特征性分子，約90%以上表現出MSI。同時并不是所有的MSI均是Lynch綜合征，在散發性CRC中也存在10%～15%的MSI。
　　（二）MSI與結直腸癌的預后
　　臨床研究證實，MSI與結直腸癌的預后有著密切的關系。MSI-H結直腸癌患者相比MSS患者具有顯著的生存優勢，臨床表現較差，但預后更好。研究證實，針對Ⅱ/Ⅲ期結直腸癌患者，MSI-H患者的總生存期及無病生存期明顯延長。美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）發布的結直腸癌指南，建議MSI檢測應在所有結直腸癌史的病人中進行。
　　（三）MSI與指導用藥
　　研究證實，MSI-H的結直腸癌Ⅱ期患者不能在氟尿嘧啶（5-FU）治療中獲益。同時因MSI-H的晚期結直腸癌患者通常具有PD-1及PDL-1等的高表達，可通過對PD-1/PD-L1的靶向抑制，促使機體免疫系統攻擊和殺滅腫瘤細胞。目前美國FDA已批準PD-1免疫治療單抗pembrolizumab、ipilimumab和nivolumab用于具有錯配修復缺陷（dMMR）/MSI-H表型的轉移性結直腸癌（mCRC）的末線治療。除了mCRC的治療外，2017年5月，美國FDA批準了PD-1抗體pembrolizumab用于治療成人和兒童具有dMMR/MSI-H表型的沒有其他治療選擇的，不可切除或轉移性實體瘤患者。
　　《中國結直腸癌診療指南》（2010版）就明確了“Ⅱ期結直腸癌，有條件者建議檢測組織標本MMR或MSI，如為dMMR或MSI-H，不推薦氟尿嘧啶類藥物的單藥輔助化療”。在《中國結直腸癌診療指南》（2017版）的組織病理學檢查部分，增加了MMR或MSI的檢測作為復發或轉移性結直腸癌的推薦檢測方法，“確定為復發或轉移性結直腸癌時，推薦檢測腫瘤組織K-ras及N-ras基因、BRAF基因、錯配修復蛋白表達或微衛星狀態及其他相關基因狀態以指導進一步治療。”
　　四、相關檢測產品介紹
　　目前國際上已上市的產品有：
　　（一）MSI-IVD Kit (FALCO)
　　日本FALCO公司的MSI-IVD Kit已獲得日本厚生勞動省的批準上市。該試劑盒采用PCR技術檢測癌組織中提取的基因組DNA中的MSI狀態，檢測7個微衛星位點（五個單核苷酸微衛星位點BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24和MONO-27及兩個五核苷酸微衛星位點Penta C和Penta D）。該產品由日本FALCO公司與Promega公司合作開發，作為伴隨診斷試劑，用于指導PD-1抗體pembrolizumab在局部晚期或轉移性癌癥患者中的應用。
　　（二）VENTANA MMR IHC panel
　　該產品采用IHC方法檢測經福爾馬林固定石蠟包埋的結直腸癌組織切片中的四種MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，及BRAF V600E
　　突變蛋白。用于Lynch綜合征的輔助診斷，同時檢測BRAF V600E突變蛋白用于散發性CRC及Lynch綜合征的輔助鑒別診斷。此產品通過De Novo途徑在美國上市。
　　（三）MSK-IMPACTTM
　　2017年11月16日，美國FDA批準紀念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，簡稱MSK）基于二代測序技術的癌癥基因檢測分析平臺MSK-IMPACTTM。該產品能夠一次對病人腫瘤468個基因的突變進行檢測，并且可以檢測MSI基因組特征。該產品僅限于在MSK中進行使用，其檢測結果不與任何藥物聯用。該產品的MSI的檢測性能通過對10,900名患有66種不同類型晚期實體瘤患者的研究進行確定。
　　（四）FoundationOne CDx (F1CDx)
　　2017年11月30日，美國FDA批準了Foundation Medicine公司針對多種實體瘤的二代測序的體外檢測產品—FoundationOne CDx（F1CDx）。該產品僅允許在Foundation Medicine公司進行檢測。這款產品除了可檢測5種腫瘤中的324個基因的突變，還可以檢測MSI和腫瘤突變負荷（TMB）兩個基因組特征，是FDA批準的首款獲得突破性認定的癌癥NGS體外診斷檢測產品。
　　五、總結
　　隨著研究的進一步深入，MSI在腫瘤的發生機制中所起的作用越來越被人們所關注。雖然近年來MSI的檢測在臨床應用方面被日趨關注，但是國內還未有注冊獲批的產品。2018年已有MSI檢測試劑盒通過國家藥品監督管理局的創新醫療器械特別審查程序，該產品采用熒光PCR-毛細管電泳法。

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臨床與生物統計二部 方麗 劉容枝 呂允鳳 審評六部 吳傳松 供稿