微生物培養與分離方法

　　接種與分離方法

　　根據待檢標本的性質、培養目的和所用培養基的種類，采用不同的接種方法。

　　1．平板劃線分離培養法

　　對混有多種細菌，采用劃線分離和培養，使原來混雜在一起的細菌沿劃線在瓊脂平板表面分離，得到分散的單個菌落，以獲得純種。平板劃線分離法通常有兩種方法：

　　①分區劃線分離法：此法常用于含菌量較多的細菌的分離。先用接種環挑取標本涂布于瓊脂平板1區（占培養基總面積的?）并作數條劃線，再于2、3、4區依次劃線。每劃完一個區域，均將接種環燒灼滅菌1次，冷后再劃下一區域，每一區域的劃線均與上一區域的劃線交接1~3次。一個成功分區劃線的平板，培養后分別觀察1區形成菌苔，2區菌落連成線，3區和4區可分離到單個菌落。

　　②連續劃線分離法：此法常用于含菌量不多的標本或培養物中的細菌分離培養。方法是先將接種物在瓊脂平板上1/5處輕輕涂抹，然后再用接種環或拭子在平板表面曲線連續劃線接種，直至劃滿瓊脂平板表面。

　　2.瓊脂斜面接種法

　　主要用于菌落的移種，以獲得純種進行鑒定和保存菌種等。用接種環（針）挑取單個菌落或培養物，從培養基斜面底部向上劃一條直線，然后再從底部沿直線向上曲折連續劃線，直至斜面近頂端處止。生化鑒定培養基斜面接種，用接種針挑取待鑒定細菌的菌落，從斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折劃線接種。

　　3．穿刺接種法

　　此法多用于半固體培養基或雙糖鐵、明膠等具有高層的培養基接種，半固體培養基的穿刺接種可用于觀察細菌的動力。接種時用接種針挑取菌落，由培養基中央垂直刺入至距管底0.4cm處，再沿穿刺線退出接種針。雙糖鐵等有高層及斜面之分的培養基，穿刺高層部分，退出接種針后直接劃線接種斜面部分。

　　4．液體培養基接種法

　　用于各種液體培養基如肉湯、蛋白胨水、糖發酵管等的接種。用接種環挑取單個菌落，傾斜液體培養管，在液面與管壁交界處研磨接種物（以試管直立后液體淹沒接種物為準）。此接種法應避免接種環與液體過多接觸，更不應在液體中混勻、攪拌，以免形成氣溶膠，造成實驗室污染。

　　5．傾注平板法

　　本法主要用于飲水、飲料、牛乳等標本中的細菌計數。取純培養物的稀釋或原標本1ml至無菌培養皿內，再將已融化并冷卻至45~50℃左右的瓊脂培養基15~20ml傾注入該無菌培養皿內，混勻，待凝固后置37℃培養，長出菌落后進行菌落計數，以求出每毫升標本中所含菌數。先數6個方格（每格為1cm2）中菌落數，求出每格的平均菌落數，并算出平皿直徑，然后按下列公式計數，求出每毫升標本中的細菌數。

　　全平板菌落數=每方格的平均菌落數×лr2

　　每ml標本中的細菌數=全平板菌落數×稀釋倍數

　　6．涂布接種法

　　本法多用于紙片擴散法藥敏試驗的細菌接種。將一定量或適量的菌液加到瓊脂培養基表面，然后用滅菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反復涂布，使被接種液均勻分布于瓊脂表面，然后貼上藥敏紙片，或直接培養，本法經培養后細菌形成菌苔。

　　細菌的培養方法

　　根據不同的標本及不同的培養目的，可選用不同的培養方法。通常把細菌的培養方法分為需氧培養、二氧化碳培養、微需氧培養和厭氧培養四種。

　　1．需氧培養

　　是指需氧菌或兼性厭氧菌在有氧條件下的培養，將已接種好的平板、斜面、液體培養基等在空氣中置35℃孵育箱內孵育18~24h，無特殊要求的細菌均可生長。少數生長緩慢的細菌需要培養3-7d甚至1個月才能生長。為使孵育箱內保持一定的濕度，可在其內放置一杯水。對培養時間較長的培養基，接種后應將試管口塞好棉塞或硅膠塞后用石蠟-凡士林封固，以防培養基干裂。

　　2．二氧化碳培養某些細菌，在初次分離時，須在5%~10%二氧化碳環境中培養才能生長。常用的培養法如下。

　　①二氧化碳培養箱法：二氧化碳孵箱能自動調節二氧化碳的含量、溫度和濕度，培養物置于孵育箱內閣，孵育一定時間后可直接觀察生長結果。

　　②燭缸培養法：取有蓋磨口標本缸或玻璃干燥器，將接種好的培養基放入缸內，點燃蠟燭后放在缸內稍高于培養物的位置上，缸蓋或缸口均涂以凡士林，加蓋密閉。因缸內蠟燭燃燒氧逐漸減少，數分鐘后蠟燭自行熄滅，此時容器內二氧化碳含量約占5%~10%。將缸置于35℃普通孵育箱內孵育。

　　③氣袋法：選用無毒透明的塑料袋，將已接種標本的培養皿放入袋內，盡量祛除袋內空氣后將開口處折疊并用彈簧夾夾緊袋口。使袋呈密閉狀態，執斷袋內已置的二氧化碳產氣管（安瓿）產生二氧化碳，數分鐘內就可達到需要的二氧化碳培養環境，置于35℃孵育箱內孵育。

　　④化學法：常用碳酸氫鈉-鹽酸法。按每升容積稱取碳酸氫鈉0.4g與濃鹽酸0.35ml比例，分別置容器內，連同容器置于玻璃缸內，蓋緊密封，傾斜缸位使鹽酸與碳酸氫鈉接觸而生成二氧化碳。于35℃孵育箱內孵育。

　　3．微需氧培養

　　微需氧菌培養在大氣中及絕對無氧環境中均不能生長，在含有5%-6% 氧氣，5%-10%二氧化碳和85%氮氣的氣體環境中才可生長，將標本接種到培養基上，置于上述氣體環境中，35℃進行培養即微需氧培養法。

　　4．厭氧培養

　　厭氧菌對氧敏感，培養過程中需造成低氧化還原電勢的厭氧環境。厭氧培養常用的方法有：物理法、化學法、生物法。如厭氧罐培養法、氣袋法、厭氧手套箱法、需氧菌共生厭氧法等。

　　細菌在培養基上生長特性

　　1．固體培養基

　　標本或液體培養物劃線接種到固體培養基表面后，單個細菌經分裂繁殖可形成一個肉眼可見的細菌集團，稱為菌落（colony）。

　　①菌落的形態特征：大小、形狀（露滴狀、圓形、菜花樣、不規則等）、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發狀等）、顏色（紅色、灰白色、黑色、綠色、無色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等。據細菌菌落表面特征不同，可將菌落分為3型：

　　A.光滑型菌落（S型菌落）：菌落表面光滑、濕潤、邊緣整齊，新分離的細菌大多呈光滑型菌落。

　　B.粗糙型菌落（R型菌落）：菌落表面粗糙、干燥、呈皺紋或顆粒狀，邊緣大多不整齊。R型菌落多為S型細菌變異失去菌體表面多糖或蛋白質形成。R型細菌抗原不完整，毒力和抗吞噬能力都比S型細菌弱。但也有少數細菌新分離的毒力株就是R型，如炭疽孢桿菌、結核分枝菌等。

　　C.粘液型菌落（M型菌落）：菌落粘稠、有光澤、似水珠樣。多見于厚莢膜或豐富粘液層的細菌、結核桿菌等。

　　②菌落溶血特征：菌落溶血有下列3種情況。

　　α溶血：又稱草綠色溶血，菌落周圍培養基出現1~2mm的草綠色環，為高鐵血紅蛋白所致；

　　β溶血：又稱完全溶血，菌落周圍形成一個完全清晰透明的溶血環，是細菌產生的溶血素使紅細胞完全溶解所致；

　　γ溶血：即不溶血，菌落周圍的培養基沒有變化，紅細胞沒有溶解或缺損。

　　③色素：有些細菌產生水溶性色素，使菌落和周圍的培養基出現綠色、金黃色、白色、橙色、檸檬色等顏色，產生的色素有水溶性或脂溶性。

　　④氣味：某些細菌在培養基中生長繁殖后可產生特殊氣味，如銅綠假單胞菌（生姜氣味）、變形桿菌（巧克力燒焦的臭味）、厭氧梭菌（腐敗的惡臭味）、白色假絲酵母菌（酵母味）和放線菌（泥土味）等。

　　2．液體培養基

　　細菌在液體培養基中有3種生長現象：大多數細菌在液體培養基生長繁殖后呈均勻混濁；少數鏈狀排列的細菌如鏈球菌、炭疽芽胞桿菌等則呈沉淀生長；枯草芽胞桿菌、結核分枝桿菌和銅綠假單胞菌等專性需氧菌一般呈表面生長，常形成菌膜。

　　3．半固體培養基

　　半固體培養基主要用于細菌動力試驗，有鞭毛的細菌除了沿穿刺線生長外，在穿刺線兩側也可見羽毛狀或云霧狀混濁生長。無鞭毛的細菌只能沿穿刺線呈明顯的線狀生長，穿刺線兩邊的培養基仍然澄清透明，為動力試驗陰性。