微生物所在CRISPR適應機制研究中獲新發現

　　眾所周知，CRISPR（全稱clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即“成簇的規律性間隔的短回文重復序列”）是廣泛分布于細菌和古菌中的一種獲得性免疫系統。該系統首先從外源病毒（或質粒）中獲取特定DNA片段并作為間隔序列（spacer）存儲在其CRISPR中，此過程稱為“適應”；然后利用相應spacer產生的crRNA識別和降解攜帶同源序列的外源質粒或病毒，此過程稱為“干擾”。顯而易見，適應過程獲得的spacer決定了干擾機器的靶分子。然而多年來，CRISPR如何在適應過程中區分異己的外源DNA和自身的染色體DNA一直困擾著科學家們。有意思的是，在大多數實驗室構建的單一病毒侵染細菌的模型中，CRISPR適應過程很難發生，這嚴重地阻礙了該領域的研究，因此CRISPR適應過程也是CRISPR研究領域中目前相對最不清楚的過程。最近，中國科學院微生物研究所向華研究員帶領的極端嗜鹽古菌研究團隊在這一領域取得重要發現，近期連續兩篇相關論文發表在國際知名期刊Nucleic Acids Research上。

　　該研究團隊首先從遼寧葫蘆島的鹽場中分離到了一株新的嗜鹽病毒HHPV-2，并在利用該病毒侵染西班牙鹽盒菌時觀察到了高效的CRISPR適應現象。通過大量的遺傳與分子生物學實驗，他們發現該嗜鹽古菌CRISPR適應過程不僅需要干擾機器的參與，而且需要CRISPR結構中已經存在的一個spacer，該spacer與病毒基因組上的某段序列具有約70%的相似性。基于上述發現，他們推測CRISPR系統借助攜帶該spacer序列信息的干擾機器，可特異地將病毒DNA識別為異己分子，并在相似序列所在DNA分子上“引發”了適應過程。接著，他們利用該“引發”模型，成功實現了CRISPR系統從特定的重組質粒上高效獲取新spacer，驗證了該機制，并進一步解析了從病毒或質粒上獲取新spacer的鏈偏好性。該工作充分說明了“引發”機制在適應過程中具有重要的異己識別作用，并有利于其在自然環境中對病毒群的整體適應。相關論文發表在Nucleic Acids Res. 42(4)：2483-2492上，博士生李明和王銳是該篇論文的并列第一作者。

　　接著，該組研究人員構建了64種重組質粒，使它們攜帶相同的protospacer序列和64種不同的三聯核苷酸充當其PAM（protospacer adjacent motif）。有意思的是，CRISPR只能干擾其中4種PAM對應的重組質粒，卻能“引發”23種PAM對應質粒（包括被干擾的4種）的適應過程，而其它41種PAM質粒則安全“躲避”了CRISPR系統的免疫。該團隊進一步證明位于宿主CRISPR結構中spacer旁邊保守的三聯核苷酸AGC（屬于上述41種PAM），是幫助spacer同時“躲避”了干擾和引發適應過程的決定性因素。該研究表明PAM驗證機制在適應過程和干擾過程中都發揮重要作用，但在適應過程中表現出更寬松的PAM選擇性，因此該過程能耐受靶分子上更多的PAM突變，同時PAM驗證機制又可以避免在宿主自身的spacer DNA處引發適應過程。該工作進一步解析了CRISPR適應過程中的異己區分機制，即“PAM驗證的引發機制”。相關論文已于近期在線發表在Nucleic Acids Research (doi： 10.1093/nar/gku389) 上，博士生李明為該篇論文的第一作者。

　　上述研究工作受到向華主持的國家杰出青年科學基金和國家自然科學基金委面上項目的資助。

CRISPR干擾與引發適應過程的異己區分模型