微生物檢驗—血清學試驗

血清學試驗是根據抗原與相應的抗體在適宜的條件下，能在體外發生特異性結合的原理，用已知抗體或抗原來檢測未知抗原或抗體。因抗體主要存在于血清中，抗原或抗體檢測時一般都要采用血清，故體外的抗原抗體反應亦稱為血清學試驗或血清學反應。血清學試驗包括血清學鑒定和血清學診斷。血清學鑒定即用含已知特異性抗體的免疫血清(診斷血清)去檢測患者標本中或培養物中的未知細菌或細菌抗原，以確定病原菌的種或型。血清學診斷是指用已知抗原檢測病人血清中的相應抗體，以診斷感染性疾病的方法。血清學試驗是臨床微生物學檢驗的重要方法之一。血清學試驗基本類型包括凝集反應、沉淀反應和補體結合反應等。

    一、凝集反應
　　 
    顆粒性抗原（細菌、紅細胞、乳膠等）與相應抗體可發生特異性結合，在一定條件下（電解質、pH、溫度、抗原抗體比例適合等）出現肉眼可見的凝集小塊，稱為凝集反應。參與反應的抗原稱凝集原，抗體稱為凝集素。凝集反應可分為直接凝集反應和間接凝集反應兩大類。

    (一)直接凝集反應

　　直接凝集反應指顆粒性抗原與相應抗體直接結合出現的凝集現象。

    1. 玻片凝集試驗

    是一種定性試驗。用己知抗體(診斷血清)測未知抗原，適用于細菌的鑒定或分群（型）等。方法是取已知抗體（診斷血清）滴加在載玻片上，直接從培養基上刮取待檢菌混勻于診斷血清中，數分鐘后，如出現細菌凝集成塊或肉眼可見的顆粒，即為反應陽性。自臨床初分離的細菌中，有些細菌表面含有某種表面抗原(如傷寒沙門菌的Vi抗原和志賀菌屬的K抗原等)，這些抗原能阻止菌體抗原(O抗原)與相應抗體發生凝集反應，從而導致錯誤的判定。此時應將菌懸液于100℃中隔水煮沸(Vi抗原100℃30min 、 K抗原100℃ 1h)，待細菌表面抗原破壞后，再進行試驗。

　　凝集試驗簡便、快速、特異性強，常用于沙門菌、志賀菌、致病性大腸埃希菌、霍亂弧菌、布氏桿菌、流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌及鏈球菌等的鑒定。

    2．試管凝集試驗

    為半定量試驗。用等量抗原(細菌)懸液與一系列遞倍稀釋的抗血清混合，37℃保溫4h后放室溫或4℃冰箱過夜，觀察結果。根據每管內抗原的凝集程度判定血清中抗體的相對含量。以血清最高稀釋度仍有明顯凝集現象者，為該血清中抗體的凝集效價，以表示血清中抗體的相對含量。 
本法常用于測定免疫血清的效價、抗原的凝集性能；在臨床上主要用于檢測受試者血清中有無某種特異性抗體及其相對含量。如診斷傷寒、副傷寒的肥達反應、診斷布氏桿菌病的瑞特反應等。

    (二)間接凝集反應

　　是將可溶性抗原或抗體吸附于某種與免疫無關一定大小的顆粒載體表面，制成致敏載體，再與相應抗體或抗原作用，在電解質存在的適宜條件下，被動地使致敏載體凝集，稱為間接（或被動）凝集反應。

　　可用紅細胞、聚苯乙烯乳膠、活性炭等顆粒作載體，分別稱間接血凝、間接乳凝、間接炭凝試驗。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應面積，當顆粒上的抗原與少量抗體結合后，就能出現肉眼可見的反應，故可提高反應的敏感性。常用間接凝集反應來測定待檢血清中細菌、病毒、螺旋體、寄生蟲等抗原及自身抗體。間接凝集反應又可分為如下3種。

    正向間接凝集試驗

    即將已知可溶性抗原吸附于載體顆粒上，然后與相應抗體結合產生顆粒凝集現象，用以檢測未知抗體。

    反向間接凝集試驗

    是將已知抗體吸附于載體顆粒表面，以檢測相應可溶性抗原的凝集反應。適用于可溶性和顆粒性抗原的檢出，如反向間接血凝試驗檢測乙型肝炎表面抗原及甲胎蛋白，協助診斷乙型肝炎和原發性肝癌。從食品中檢出肉毒毒素和葡萄球菌腸毒素等。 檢驗地帶網 

    間接凝集抑制試驗

    是將已知抗體或可溶性抗原先與被測的抗原或抗體混合，然后加入有關抗原或抗體致敏的載體顆粒，如已知抗體或可溶性抗原與被測的抗原或抗體相結合，則不出現顆粒凝集現象。故也可稱為正向間接凝集抑制試驗或反向間接凝集抑制試驗。

    協同凝集試驗

    協同凝集反應屬于間接凝集反應的一種類型。它所用的載體是含SPA（葡萄球菌A蛋白）金黃色葡萄球菌。 SPA能與人及多種哺乳動物血清中IgG類抗體的Fc段結合，IgG的Fc段與SPA結合后，IgG的兩個Fab 段暴露于葡萄球菌菌體的表面，并仍保持正常的抗體活性，當結合于葡萄球菌表面的已知抗體與相應細菌、病毒或毒素抗原接觸時，則出現肉眼可見的凝集現象。方法簡便、快速、敏感性高，易于觀察結果，已廣泛用于細菌的快速鑒定和分群（型），如腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌、肺炎鏈球菌、乙型溶血性鏈球菌、布魯氏菌、沙 門菌及志賀菌等細菌。

    二、沉淀反應

    可溶性抗原(如細菌的培養濾液、含細菌的患者血清、腦脊液及組織浸出液等)與相應抗體相混合，在比例適合和適量電解質的存在等條件下，形成肉眼可見的沉淀物，稱沉淀反應。利用沉淀反應進行血清學試驗的方法稱為沉淀試驗。沉淀反應有環狀、絮狀和瓊脂擴散法3種基本類型。

    1．環狀沉淀試驗

    將已知的抗血清加于內徑1~3mm，長75mm的玻璃細管中約三分之一高度，然后沿管壁徐徐加入已適當稀釋的待測抗原溶液，使成為分界清晰的二層，置室溫或35℃5~30min后，如在兩液面交界處形成肉眼可見的白色環狀沉淀物為陽性反應。本試驗主要用于鑒定微量抗原，如鏈球菌、肺炎鏈球菌、鼠疫耶爾森菌的鑒定及炭疽的診斷（Ascoli氏試驗）。

    絮狀沉淀試驗

    指可溶性抗原與抗體在試管內以適當比例混合后，在電解質存在的條件下，出現絮狀的沉淀物。有2種方法：一種是將恒定量的抗體分別與一系列稀釋的抗原溶液在試管內混合，另一種是將恒定量的抗原分別與一系列稀釋的抗血清在試管內混合，隨后觀察各管沉淀物出現的時間和量。通常在抗原與抗體比例最適管，出現沉淀物最快，量最多。本試驗常用于毒素、類毒素、抗毒素的定量測定，還用于已知抗原測血清中的相應抗體，如肥達氏試驗用于診斷傷寒、副傷寒等。 

    瓊脂擴散試驗

    用瓊脂制成固體的凝膠，使抗原和抗體在凝膠中擴散，若兩者比例適當，則在相遇處形成肉眼可見的沉淀物（線或環），為陽性反應。常用的試驗方法有：

    (1)單向瓊脂擴散試驗：是將抗體預先在瓊脂中混勻，制成凝膠板，凝固后在瓊脂上打孔，孔中加入待試抗原，經一定時間擴散后，若抗原與抗體對應，則在孔周圍比例適當處形成白色沉淀環。由于沉淀環大小與直徑孔中抗原濃度成正比關系，故可事先用不同濃度的標準抗原制成標準曲線，來測定未知標本中抗原含量。本法是一種定量試驗，主要用于檢測標本中各種免疫球蛋白和血清中各種補體成分的含量。

    (2)雙向瓊脂擴散試驗：先制備瓊脂凝膠板，待凝固后，根據需要在其上面多少個孔，孔間保持一定距離，然后將抗原和抗體分別注入小孔中，使兩者相互擴散。如抗原與抗體相對應，濃度比例適當，經一定時間擴散后，在抗原抗體孔之間出現清晰的白色沉淀線。一對相應的抗原抗體只能形成一條線。因此，根據沉淀線的數目即可推測抗原液中有多少種抗原成分，根據沉淀線融合與否及交叉關系，還可鑒定兩種抗原是否完全相同，還是部分相同。本法可用于檢測未知抗原或抗體、分析和鑒定抗原成分、檢測抗體或抗原的純度、滴定抗血清的效價等。缺點是需時長，敏感性差。 

    (3)對流免疫電泳：是一種將雙向擴散和電泳技術相結合的方法。試驗時按雙向擴散法在瓊脂板上打孔，抗原加于陰極側的孔中，抗體加于陽極側的孔中，然后通電，在電場與電滲作用下抗原與抗體向相對方向移動，兩者相遇后即可出現沉淀線。

    (4)免疫電泳：是將瓊脂電泳與雙向瓊脂擴散相結合的方法。先將抗原在瓊脂平板上進行電泳，使其中各成分因電泳遷移率不同而分離區帶。爾后沿電泳方向挖一與之平行的槽，加入特異性抗體作雙向瓊脂擴散。各區帶中抗原分別在不同位置與抗體相遇生成弧狀沉淀線。可據沉淀弧的數量、位置和形狀，與已知標準抗原比對，即可分析樣品中的成分及其性質。免疫電泳主要用于血清蛋白的組分分析。亦用于抗原和抗體提純物的純度鑒定。

    三、補體結合反應

    是一種在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素為指示系統的抗原抗體反應。在試驗時，先將定量補體（使用新鮮的豚鼠血清）加入待檢系統中，使抗原抗體優先結合補體。如果待檢系統中抗原與抗體相對應，加入的補體可被抗原抗體復合物所結合而固定，不再與以后加入的溶血系統起反應，不出現溶血現象，為補體結合反應陽性。如待檢系統中的抗原抗體不相對應，則游離的補體與后面加入的溶血系統反應，從而出現溶血，為補體結合反應陰性。如果待檢系統中抗原抗體比例不適當時，仍有部分補體游離，則此剩余的游離補體可作用于溶血系統產生不同程度的溶血現象，據此可判斷陽性反應的強弱，推知抗原或抗體的效價。

    本反應可用已知抗原測定未知抗體，也可用已知抗體測未知抗原。多用于檢測某些病毒、立克次體和螺旋體病病人血清中的抗體。亦用于某些病毒分型試驗。

    四、莢膜腫脹試驗

    1．原理

    特異性抗血清與相應細菌的莢膜抗原特異性結合形成復合物時，可使細菌莢膜顯著增大出現腫脹。

    2．方法

    取潔凈載玻片一張，兩側各加待檢菌1~2接種環，于一側加抗血清，另一側加正常兔血清各1~2接種環，混勻；再于兩側各加1％亞甲藍(美藍)水溶液1接種環，混勻，分別加蓋玻片，置濕盒中室溫放置5~10min后鏡檢。 

    3.結果

    若試驗側在藍色細菌周圍可見厚薄不等、邊界清晰的無色環狀物而對照側無此現象，為莢膜腫脹試驗陽性；試驗側與對照側均不產生無色環狀物則為莢膜腫脹試驗陰性。

    4.應用

    常用于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和炭疽芽胞梭菌等檢測。

    五、制動試驗

    原理

    特異性抗鞭毛血清與相應運動活潑的細菌懸液混合，則抗鞭毛抗體與鞭毛抗原結合，使鞭毛強直、相互粘著而失去動力，細菌運動停止。

    方法

    將待檢標本或增菌培養液1滴置于潔凈玻片上，用顯微鏡觀察細菌運動情況。再于待檢標本上加 l滴適當稀釋的特異的抗鞭毛血清，混勻，作懸滴鏡檢。

    結果

    若滴加抗血清后3~5min內，細菌運動停止，菌體凝集成塊為制動試驗陽性；反之，滴加抗血清后，細菌運動無改變為制動試驗陰性。

    應用：主要用于霍亂弧菌的快速鑒定。