1)原理
同常量凱氏定氮法。
2)主要儀器
①凱氏燒瓶(100mL)。
②微量凱氏定氮蒸餾裝置
3)試劑
①0.0100mol/L鹽酸標準溶液。
②20g/L硼酸吸收液:稱取20g硼酸溶解于1000mL熱水中,搖勻備用。
③其他試劑同常量凱氏定氮法。
4)操作方法
(1)樣品消化 精密稱取均勻固體樣品0.2～2.0g,或半固體樣品2～5g或吸取液體樣品10～20mL,小心移入100mL干燥的凱氏燒瓶中。向瓶內加入0.2g硫酸銅、3g硫酸鉀及一定量的濃硫酸(每克樣品加硫酸15mL)將凱氏燒瓶45°傾斜置于電爐上。同常量法消化至消化液呈透明藍綠色溶液時,再繼續加熱0.5h,完成消化。待消化液冷至室溫后,用蒸餾水干凈地轉入100mL容量瓶中,并用蒸餾水定容,搖勻,備用。
(2)蒸餾與吸收 連接好微量定氮裝置,于水蒸氣發生瓶內裝水至2/3容積處,加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升,以保持水呈酸性,加入數粒玻璃珠,加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。檢查裝置的氣密性。
在接收瓶內加入25mL20g/L硼酸及2滴混合指示劑,將冷凝管下端插入液面以下。準確量取消化稀釋液10mL,經漏斗加入反應管內,用少量蒸餾水沖洗漏斗。經漏斗再加入10mL400g/L氫氧化鈉溶液,使呈強堿性,立即夾好漏斗夾,并加少量水于進樣漏斗中封口,以防漏氣。夾緊廢液排出口的螺旋夾,進行水蒸氣蒸餾。蒸餾至冷凝管下端的吸收液變為綠色開始計時,繼續蒸餾3min后,將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min,用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。蒸餾結束時,夾緊簧夾,斷絕蒸汽,使蒸餾瓶內的溶液吸入回流管中。松開彈簧夾,從漏斗加入蒸餾水40～50mL,再通蒸汽加熱回流,將蒸餾瓶洗滌一次備用。
(3)滴定 吸收液用0.0100mol/L鹽酸標準溶液滴定至微紅色為終點。
(4)空白試驗 不加試樣,按上述操作作空白試驗。
5)計算
式中 w——蛋白質的質量分數,%;
V0——滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標準液體積,mL;
V1——滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標準液體積,mL;
c——鹽酸標準液的濃度,mol/L;
0.014——氮的摩爾質量,g/mol;
F——蛋白質系數;
m——樣品質量,g;
V2——蒸餾所加樣品消化液的量,mL。
6)說明
①蒸餾前給水蒸氣發生器內裝水至2/3體積處,加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升,以使其始終保持酸性,這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測定結果,同時可以指示因水蒸氣氣壓不足而使氨氣發生倒吸溶于水中,使得測定結果偏低。
②在蒸餾時,蒸汽發生要均勻充足,蒸餾過程中不得停火斷汽,否則將發生倒吸。
③加堿要足量,操作要迅速;漏斗應采用水封措施,以免氨由此逸出損失。