微陣列—比較基因組雜交技術檢測染色體異常

【摘要】近年微陣列一比較基因組雜交(microarraycomparativegenomichybirdization，microarray．CGH)技術被應用到臨床細胞遺傳學領域。該技術是選擇DNA特殊片段作為靶，固化在載體上，形成密集、有序的分子微陣列。然后，從測試標本中提取DNA，將測試DNA和參考DNA用不同的熒光色素標記，雜交到微陣列上，通過檢測這兩種熒光色素的比率，了解待測標本基因拷貝數的變化。其能夠檢測染色體亞微結構異常。微陣列技術已成為一個重要的工具，用于產前、產后和植人前診斷染色體亞微結構異常。

在過去30年中，染色體核型分析是診斷染色體病的標準方法。近年來，微陣列一比較基因組雜交(microarraycomparativegenomichybridization，microarray—CGH)技術用于染色體病研究中．該技術又稱為“分子核型分析”。可對染色體亞微結構異常進行診斷．本文主要介紹microarray—CGH技術在細胞遺傳學方面的應用。microarray—CGH技術簡介

一、技術原理與發展

microarray—CGH技術是近年發展起來的一種分子細胞學技術，雖然與傳統的比較基因組雜交(CGH)技術基于相同的原理，但傳統的CGH是選擇中期分裂相作為靶．而microarray．CGH是選擇DNA特殊片段作為靶，固化在載體上，形成密集、有序的分子微陣列。因為DNA的特殊片段作靶，可以根據DNA片段大小及密度決定解析度。microarray—CGH可檢測到那些不能為傳統方法檢測到的微重復和缺失。為與傳統的核型分析相比較，這種全染色體組陣列檢測稱為“分子核型分析”。最初．microarray—CGH引入腫瘤細胞遺傳學研究領域，是因為腫瘤細胞培養困難，所獲得中期分裂相形態欠佳．而且腫瘤細胞染色體改變復雜，用

傳統染色體分析方法很難監測到遺傳物質微小缺失和重復。應用全基因組的microarray—CGH研究大量的腫瘤標本，可以繪出常發生基因拷貝數改變的區域。而用高密度的microarray—CGH能對這些區域基因拷貝數改變進行詳細的分析[。依照基因拷貝數變化的類型和數目可對腫瘤進行分型，鑒別引起腫瘤發生發展的基因[。而最近該技術已用于臨

床細胞遺傳學，檢測有臨床表現的染色體微缺失和微重復綜合征Es-9]。

二、技術特點

與傳統的核型相比，分子核型顯示很多的優越性。但microarray—CGH并不能代替傳統的染色體分析，因為，其不能檢測染色體的平衡易位及多倍體。microarray—CGH是通過檢測患者和對照組的基因拷貝數的變化來發現異常的。在平衡易位沒有基因拷貝數的變化，因此，不能檢測平衡易位。另外，microarray—CGH是通過檢測熒光強度的比率來鑒別異常，而來自三倍體的雙倍染料的熒光強度最終認為是正常的，所以也不能檢測多倍體。

近年來．microarray—CGH開始用于臨床細胞遺傳學的研究，現將研究結果從3個方面進行綜述。檢測流產絨毛染色體目前，臨床上用絨毛組織制備染色體診斷流產胚胎是否有染色體異常。通常絨毛細胞培養方面存在一些問題。包括：高發培養失敗，母親細胞過度生長，染色體形態不佳等。因此，盡管胎兒染色體有異常。有時也難以發現。Schaeffer等2004年首次發表用microarray-CGH技術檢查流產胚胎的染色體。在這項研究中，選擇的DNA．array包括每條染色體的末端端粒，所有微小缺失綜合征DNA特殊片段。還另外選擇一些特

殊位點DNA片段。分析41個流產胚胎，microarray—CGH不僅檢測到染色體G帶分析發現的所有異常，而且還查到4例染色體亞微結構異常。隨后Shimokawa等m]也發表類似的報道，在20例常規染色體分析顯示正常核型的流產絨毛標本中，用microarray—CGH分析發現其中1例有3號染色體短臂微缺失。Benkhalifa等和Fritz等[]的研究顯示，microarray—CGH具有檢測在培養中未增殖細胞的染色體異常的能力。因此。其可檢測到常規染色體分析不能發現的染色體異常。

microarray—CGH不僅能檢測染色體亞微結構異常，由于其使用標本中提取的DNA進行檢測．microarray—CGH還能解決絨毛細胞培養失敗所引起的問題。如果將microarray．CGH應用到流產胚胎的染色體的檢查中，將能更快、更精確地得到診斷結果。檢測多發畸形兒。智力低下兒染色體異常近年來，microarray—CGH技術也應用到多發畸形兒，智力低下兒病因學調查中。LeCaignec等用商業化array試劑盒(包括所有染色體的末端，主要的染色體微缺失綜合征及201個覆蓋全染色體組的區域)檢測49例有3個以上畸形但染色體核型正常的患兒，發現8個亞微結構的異常，包括末端和內部的缺失。亞微結構重復以及復雜的基因不平衡。4例基因型和表型之間有明顯的聯系。6q末端微缺失在1例母親和其2個多發畸形嬰兒中都監測到，這使得基因型和表型之間的關系不清。另外，3例監測到10q的微重復．這可能是一種遺傳多態。其結果顯示，microarray—CGH除能檢測到染色體的亞顯微結構異常外．還能發現一些基因的遺傳多態。

Schoumans等[]用microarray．CGH檢測一組不明原因智力低下患兒。這4l例患兒都有不明原因的智力低下和多發畸形，常規染色體檢查未發現異常。30例曾進行多末端位點的原位熒光雜交(lfuorescentinsituhybridsation，FISH)篩查，11例曾進行光譜核型分析(spectralkaryotyping，Sky)均未發現異常。應用商業化的試劑盒(2600BAC的克隆，以1Mb的間距分散在整個染色體組)對這4l例患兒進行檢測。發現4例有染色體亞顯微結構異常，該異常的基因片段長度范圍在1～14Mb之間。Nowakowska等[]進一步證實microarray—CGH

技術在監測染色體亞微結構異常方面的作用。用染色體微陣列分析(chromosomalmicroarrayanalysis．CMA)技術對9l例智力低下但染色體核型正常患兒進行分析，發現19例(20．8％)患兒有基因拷貝數變化，其中11例(11．8％)基因拷貝數變化與臨床表現有關，認為6例(6．5％)是遺傳多態。2例(2．1％)基因拷貝數的變化意義不明，異常基因片段長度在0．5～12．9Mb之間。最近，Tsuchiya等用microarray—CGH技術對

4例帶有額外標記小染色體的患者進行研究發現．額外小染色體的結構比預想的結構要復雜得多，其他分子細胞遺傳學方法無法對其進行詳細解析。microarray．CGH技術在細胞遺傳學領域的應用將有助于對額外小染色體的解析及更進一步了解其與表型的關系。

在產前診斷中的應用

染色體核型分析應用于產前診斷有三十多年的歷史，一直認為是標準的產前診斷方法。雖然核型分析法可準確地鑒別非整倍體和大的染色體結構異常，但這種技術在解析度方面有明顯的限制。另一個缺點是由于羊水中活細胞很少，在核型分析前，必須進行1～2周細胞培養。患者等待結果時間長。高危妊娠需要一種快速的檢測方法。而microarray．CGH技術能克服這些缺點。如果microarray—CGH能夠用于未培養的細胞．可大大縮短患者等待結果的時間。為此目標，Larrabee等用從羊水中提取的游離DNA進行microarray—CGH分析。研究中首先調查11例男性胎兒羊水中游離DNA，與女性胎兒DNA相比較，在SRY基因有明顯增強的陽性信號和減少的x染色體特殊位點信號。然后又調查3例21一三體的胎兒，與二倍體比較，在21一三體特殊位點信號明顯增加；另外還調查1例x單體的胎兒，在大多數x染色體的特殊位點信號明顯減少。結果顯示，從羊水中抽取游離的DNA，用microarray—CGH分析，能正確診斷胎兒的性別和染色體數目異常。而且這種技術將有可能成為對胎兒全染色體組進行篩查的方法。

microarray—CGH在監測染色體亞微結構異常的同時，也能檢測到遺傳多態，因此，將其應用到產前診斷中應慎重考慮其解析度和構成。如果用解析度很高的array．可能檢測到一些與臨床表現無關的基因拷貝數變化。選擇1種低密度的array，覆蓋全基因組，平均解析度是10Mb，但在一些區域增加密度，以便檢測微小缺失和微小重復綜合征和亞末端的缺失。Rickman]用這種方法調查30份產前和產后的標本，除了1例三倍體以外，檢測到這組標

本中曾被核型分析及FISH法檢測的所有異常。另外，與1Mb的array相比較，證實檢測率有改進。最近．Shaffer等[加]用microarray．CGH技術在151份產前標本中檢測到1．3％的患兒有染色體異常：而在1375例新生兒中11．4％的患兒有染色體異常。認為造成檢測比率的差異是由于40％的新生兒是因為有畸形才進行microaray—CGH檢測的。而超聲及產前篩查不能發現這些異常。如果將microaray—CGH應用到產前篩查，那么。在產前診斷

中就會發現更多的異常胎兒。

microaray—CGH技術的特點，使一些染色體亞微結構異常兒在宮內得到診斷。同時，用DNA進行檢測不需要細胞培養，可快速得到診斷結果。因此該技術在未來的產前診斷領域中有廣泛的應用前景。

發展前景

microarray．CGH技術特點使其能檢測染色體的亞微結構異常．而且，有可能實現快速和自動檢測標本。在細胞遺傳學領域將起到重要的作用。使目前條件下無法檢測的由于染色體亞微結構異常造成的疾病得到診斷。同時，可大大減少檢驗花費的時間和人力。在很大程度上將代替染色體核型分析法。由于不能檢測染色體的平衡易位和多倍體，因此．傳統的染色體檢查法也將繼續保留在染色體病的診斷中。