顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區分的兩個物點的最小間距的能力。
其計算公式是σ=λ/NA
式中σ為分辨率；λ為光線的波長；NA為物鏡的數值孔徑（NA=nsina/2,n為介質的折射率，a為孔徑角，即樣品對物鏡孔徑角）。可見物鏡的分辨率是由物鏡的NA值與照明光源的波長兩個因素決定。NA值越大，照明光線波長越短，則σ值越小，分辨率就越高。
要提高分辨率，即減小σ值，可采取以下措施
（1） 降低波長λ值，使用短波長光源。
（2） 增大介質n值以提高NA值（NA=nsina/2）。
（3） 增大孔徑角a值以提高NA值。
（4） 增加明暗反差。
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