怎樣設計引物

一般是通過設計軟件，例如oligo6，primer5等，你可以在網上搜一下引物設計軟件下載和使用說明，是比較容易的。
至于設計引物的一般原則如下：
* 序列選取應在基因的保守區段
* 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之間的TM相差避免超過2℃
* 引物的3’端避免使用堿基A，引物的3’端避免出現3個或3個以上連續相同的堿基
* 為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
* Taqman探針PCR要求片段長度在80bp－150bp
* 引物末端（最后5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。