急性瘦肉精中毒檢材的QuEChERS凈化液質聯用快速確證方法

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β2型受體激動劑(又稱瘦肉精)是一類人工合成藥物,主要用于人、獸支氣管哮喘的防治,同時對動物能起到降低脂肪含量提高瘦肉率的作用[1]。 人攝入瘦肉精后可能引起血壓升高、心率加快、頭暈、心悸等心血管系統中毒反應,嚴重的甚至導致死亡[2,3]。 鑒于其對人體健康危害的嚴重性,2002年我國就已將 β2受體激動劑列入《食用動物禁用獸藥及其化合物清單》,規定動物源性食品中不得檢出[4]。 董峰光等[5]對煙臺市2012-2017年間市售畜禽肉中 β受體激動劑污染狀況及危險性進行了評估,發現依然有違法添加情況,且農貿市場樣品中 β受體激動劑的檢出率高于商店和網店。

目前,動物源性食品中瘦肉精的測定方法有酶聯免疫吸附法[6]、氣相色譜-質譜法[7,8]、液相色譜法[9]、毛細管電泳[10]以及液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)[11,12,13]等。 與其它方法相比較, HPLC-MS/MS具有靈敏度高、重現性好、抗干擾能力強和定性能力強等特點,是痕量獸藥殘留分析的首選方法,在瘦肉精殘留檢測中應用廣泛。 酶水解提取結合固相萃取凈化常用于動物性食品中 β2受體激動劑分析的樣品前處理[14],也是國標(GB/T 21313-2007)中瘦肉精殘留測定中采用的方法,缺點是處理時間長、步驟繁瑣、材料成本高以及需特殊儀器設備。 QuEChERS(Quick,Easy,Cheap,Effective,Rugged和Safe)樣品前處理方法以快速、簡單、價格低廉、有效和耐用著稱,目前已用于多種 β型受體激動劑殘留的分析[15,16]。 但以往的QuEChERS方法往往需要稱量每一種吸附材料的質量,再進行條件優化,導致大批量樣品的分析效率低,方法開發難度大,本研究采用商品化QuEChERS試劑盒可以大大簡化操作過程。 本文擬對酸水解和酶水解兩種提取方式進行對比研究,結合QuEChERS凈化和液相色譜串聯質譜,建立動物性食品中特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克侖特羅4種 β2型受體激動劑的快速定性定量確證檢測方法。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

沙丁胺醇(18559-94-9)、特布他林半硫酸鹽(23031-32-5)、萊克多巴胺鹽酸鹽(90274-24-1)、克倫特羅鹽酸鹽(37148-27-9)(純度≥97%)以及沙丁胺醇-D3內標(100 mg/L)購自德國DR公司;特布他林-D9內標和萊克多巴胺-D6內標(純度≥98%)購自加拿大TRC公司;克倫特羅-D9內標(純度≥98%)購自德國WITEGA公司。乙酸乙酯、甲醇、甲酸和乙酸銨購自德國CNW公司,試劑純度為色譜純; β-葡萄糖酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶(≥8500 units/mg)購自美國Sigma公司;NaOH和三氯乙酸購自國藥集團化學試劑有限公司(分析純)。 明澈TM-D 24UV純水系統(Merck Millipore)制備一級純水。

HPLC串聯三重四級桿MS:配備Aglilent1260型HPLC(美國安捷倫公司)和API4000型MS(配備電噴霧離子源,美國AB公司);EVA32型多功能樣品氮吹濃縮儀(北京普立泰科);PQS-3型瘦肉精專用高效QuEChERS樣品前處理試劑盒(北京普立泰科);Coulter X-12R型低溫高速離心機(美國貝克曼庫爾特公司);AG-285型精密電子天平(法國梅特爾公司);TW20型恒溫水浴箱(德國優萊博公司);AS3120B型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);GD-16型高速研磨均質儀(深圳新銳科技公司)。

1.2 標準溶液配制

分別準確稱取適量標準品,用甲醇溶解,配制成質量濃度為100 mg/L的儲備液;準確吸取上述標準儲備液各1 mL,用初始流動相比例的溶劑定容至100 mL,配制成質量濃度為1 mg/L的混合標準溶液;逐級稀釋混合標準溶液,配成以下質量濃度:0、10、20、50、100 和200 μg/L。 內標標準溶液配制方法同上,用初始流動相比例的溶劑配成濃度為100 μg/L的混合內標使用液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 酸水解提取法

豬肉或牛肉樣品切成小塊后經均質儀充分攪碎混勻,稱取2 g(精確至0.01 g)置于QuEChERS萃取管中,加入內標混合溶液(內標最終濃度2.5 μg/L),以1：1(體積比)的甲醇-水溶液(含質量分數1%的三氯乙酸)20 mL分兩次提取,振蕩混勻后,在9000 r/min、4℃下離心5 min,合并上清液。 取上清液10 mL至QuEChERS凈化管中,振蕩混勻后在9000 r/min、4 ℃下離心5 min。取上清液于50 ℃水浴、微弱N2氣流下吹至剩余液體約3 mL,以10 moL/L氫氧化鈉溶液調節pH=11.0,采用10 mL乙酸乙酯分兩次提取,振蕩混合后于9000 r/min、4 ℃下離心5 min,合并乙酸乙酯層,氮吹至近干。 加入1.0 mL初始流動相溶劑,過0.22 μm濾膜后供HPLC-MS/MS分析。

1.3.2 酶水解提取法

豬肉或牛肉樣品切成小塊后經均質儀充分攪碎混勻,稱取2 g(精確至0.01 g)置于QuEChERS萃取管中,加入內標混合溶液(內標最終濃度2.5 μg/L)和2.0 moL/L乙酸銨溶液(pH=5.2)10 mL,振蕩混勻,加入 β-葡萄糖酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶100 μL,置于37 ℃水浴箱中水解16 h(期間多次取出振蕩混勻)。 取出樣品,冷卻至室溫,加入甲醇10 mL,振蕩混勻,9000 r/min、4 ℃下離心5 min,重復提取1次,合并上清液。 吸取10 mL上清液至QuEChERS凈化管中,9000 r/min、4 ℃下離心5 min,收集上清液于50 ℃水浴、微弱氮氣流下吹至剩余液體約3 mL,后續操作同酸水解提取法。

1.3.3 混合基質標準溶液制備

稱取陰性樣品,按酶水解法樣品提取及凈化步驟,得到空白基質溶液。吸取混合標準使用液系列各0.1 mL,用空白基質溶液定容至1.0 mL,得到混合基質標準溶液系列濃度為0、1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 μg/L,內標濃度均為2.5 μg/L。

1.4 色譜、質譜條件

色譜條件 色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×100 mm),柱溫40 ℃,進樣體積10 μL,流速300 μL/min;流動相A相為甲醇,B相為水,A相和B相均含0.1%甲酸;梯度洗脫程序:0~2.0 min,5%A;2.0~6.0 min,5%90%A;6.0~13.0 min,90%A;13.1~20.0 min,5%A。

質譜條件 電噴霧離子源正離子掃描(ESI+),多反應監測模式(multiple reaction monitoring,MRM);離子化電壓4500 V,霧化氣壓力0.38 MPa,氣簾氣壓力0.17 MPa,輔助氣流速0.38 MPa,離子源溫度550 ℃,碰撞池出口電壓8 V,駐留時間100 ms。

2 結果與討論

2.1 色譜質譜條件優化

采用微量進樣泵將100 μg/L的特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克倫特羅標準溶液以10 μL/min速度連續注入質譜系統,通過一級質譜質譜掃描確認目標化合物的準分子離子,優化去簇電壓(Declustering Potential,DP)和入口電壓(Entrance Potential,EP)。 以準分子離子為母離子進行二級質譜掃描,優化碰撞能量(Collision Energy,CE)和碰撞室出口電壓,選擇豐度較高又穩定的碎片離子分別為定性、定量子離子。 按照歐盟2002/657/EC對于獸藥殘留等禁用藥物檢測的規定,液相色譜串聯質譜中選定1個母離子和2個子離子即可滿足定性確證所需4個鑒定點的要求,從而達到定性確證的目的。 優化后部分質譜參數見表1。

表1 4種瘦肉精質譜參數Table 1 MS parameters for 4 compounds

色譜分離采用Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱,該色譜柱適用pH值范圍廣(pH 1~12),同時對目標化合物具有良好的保留。 流動相為含0.1%甲酸的甲醇(A相)和水(B相),流動相中加入甲酸能夠提高4種化合物在ESI+模式下的離子化效率。 此外,當樣品中甲醇比例低于5%時,被分析物峰形良好、分離度好、靈敏度高,可達到基線分離。 如圖1所示,出峰順序依次為特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克侖特羅。

	Figure Option
	圖1 基質匹配混合標準溶液總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram(TIC) of the matrix-matched mixed standard solution(5.0 μg/L) of 4 compounds(internal standard:2.5 μg/L) a.terbutaline; b.salbutamol; c.ractompamine; d.clenbuterol

2.2 樣品提取和凈化

目前常用 β-葡萄糖酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶酶水解的方式將結合態轉化為游離態,后續結合固相萃取凈化,整個樣品處理過程耗時較長,在急性瘦肉精中毒事件發生以后應急響應較慢。 本文采用甲醇水溶液(含1%三氯乙酸)提取,三氯乙酸具有釋放結合態瘦肉精和沉淀蛋白的作用,同時提供酸性溶液環境,利于弱堿性瘦肉精離子化后的提取。 提取液經QuEChERS凈化、乙酸乙酯反提以及氮吹、復溶,整個前處理過程可保持在1 h之內,非常適合急性瘦肉精中毒事件應急檢測的快速響應。 同時將酸水解提取與酶水解提取進行對比,加入 β-葡萄糖酸苷肽酶/芳基硫酸酯酶在2.0 mol/L乙酸銨緩沖溶液(pH=5.2)中37 ℃恒溫水浴反應過夜,后續處理同酸水解法。 QuEChERS凈化管中的C18、石墨化炭黑(GCB)、 N-丙基乙二胺(PSA)吸附劑能夠有效吸附脂質、色素和有機酸、重金屬等干擾成分,對色譜柱起到保護作用的同時也可減少質譜干擾。 此外,特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克侖特羅均為弱堿性化合物,凈化液經濃NaOH溶液調節pH=11.0時呈分子狀態,更容易進入乙酸乙酯層。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

按酶水解法處理得到空白陰性樣品,添加同位素內標混標和不同濃度的標準溶液混標制備基質匹配標準溶液進樣分析。 以目標化合物濃度作為橫坐標,被分析物定量離子峰峰面積與相應內標的定量離子峰峰面積比值作為縱坐標,獲得各被分析物的標準曲線和線性范圍,線性范圍均為1.020.0 μg/L,線性相關系數均大于0.999。 按3倍信噪比( S/N=3)和10倍信噪比( S/N=10)對應的濃度作為檢出限和定量限,分別為0.1 μg/kg和0.3 μg/kg,結果與國家標準檢驗方法相當。

2.4 準確度和精密度

向豬肉和牛肉樣品中添加2.0和10.0 μg/kg兩個水平的4種 β2受體激動劑混合標準溶液及同位素內標混標,按酶水解法提取樣品,每個濃度水平平行制備6份樣品并測定。 被分析物在豬肉和牛肉中的回收率范圍分別為85.6%~112%和78.5%~110%,相對標準偏差(RSD)分別為2.8%~7.5%和4.5%~8.9%(表2)。 符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中樣品含量≤0.100 mg/kg時,回收率介于60%~120%、精密度介于0%~20%之間的規定,表明酶水解法結果準確、可靠。

表2 加標回收率及精密度試驗結果( n=6)Table 2 Results of recoveries and precisions( n=6)

2.5 實際樣品分析

從市場購買豬肉和牛肉樣品,按照前述樣品制備方法制備樣品,檢測到豬肉萊克多巴胺陽性樣品1份,牛肉克倫特羅陽性樣品3份。 分別采用酸水解提取法和酶水解提取法測得豬肉樣品中萊克多巴胺含量為8.16和10.4 μg/kg,測得牛肉樣品中克倫特羅含量分別為1.09、2.70、3.74 μg/kg和1.31、2.65、3.75 μg/kg。 根據文獻[17],克倫特羅為苯胺型結構,蛋白結合率低,動物組織中主要以游離形式存在,而萊克多巴胺為苯酚型結構,苯環上的極性基團極易與體內的葡萄糖醛苷酸等發生軛合反應,大部分呈結合態形式存在。 對酸水解和酶水解兩種提取方式結合QuEChERS凈化及HPLC-MS/MS測定的結果顯示,酸水解提取法和酶水解提取法處理樣品均能檢測到萊克多巴胺和克倫特羅。 克倫特羅采用酸水解提取法和酶水解提取法所得結果相近,而萊克多巴胺酸水解提取法所得結果比酶水解法低約20%,表明酸水解法也具有釋放結合態瘦肉精的作用,但與酶水解法相比釋放程度稍低。 使用酸水解和酶水解提取所得空白及陽性樣品提取離子流色譜圖如圖2所示,豬肉和牛肉陰性樣品在萊克多巴胺和克倫特羅標準品出峰位置無干擾峰出現,陽性樣品中萊克多巴胺、克倫特羅與相近濃度的基質匹配標準溶液的保留時間、定性定量離子對及豐度比結果一致。

	圖2 酸水解和酶水解MRM對比譜圖Fig.2 MRM chromatograms of samples by acid hydrolysis extraction and enzymatic hydrolysis extraction A.acid hydrolysis extraction method; B.enzymatic hydrolysis extraction method

3 結 論

采用酸水解提取和酶水解提取結合QuEChERS凈化-HPLC/MS/MS建立了特布他林、沙丁胺醇、萊克多巴胺和克侖特羅的快速定性確證和定量檢測方法。 其中酸水解提取所需時間較短,可實現對中毒檢材的快速定性確證,有助于臨床醫生的鑒別診斷及對中毒病人的及時臨床救治,后續利用酶水解提取方法進行準確定量檢測。 本方法除了用于急性瘦肉精中毒應急檢測,還可望用于食品安全風險監測日常檢測工作中。