總cDNA探針的同位素隨機標記及點雜交

實驗概要

本實驗方法介紹了總cDNA探針的同位素隨機標記及點膜雜交技術。

實驗步驟

1. 總cDNA探針的同位素隨機標記

參照Promega公司試劑盒說明書提供的實驗流程進行。

   1) 將除Klenow大片段外的所有藥品，在冰上溶化；

   2) 取25ng總cDNA作為模板，100℃，l0min，立即冰上冷卻；

   3) 在Ep管中加入下列成分：

   5X標記buffer   10ul

   未標記dNTP混合物(dTTP，dCTP，dGTP)   2ul

   變性的cDNA模板   10ul(25ng)

   nuclease-free BSA   2ul

   (α-³²P)dATP   3ul

   DNA polymerase (klenow frament)   1ul

   nuclease-free water   補足50ul

   4) 輕輕混合，37℃，1h；

   5) 加熱95-100℃，2min，終止反應，冰上待用；

   6) 雜交前，100℃，煮沸10 min。

2. 點膜

   1) PCR產物定量成相同濃度，按1/10，1/100，1/1000三個梯度稀釋；

   2) 樣品中加入0.4N NaOH，等體積與PCR產物混合，變性30 min；

   3) 各取1ul點到膜上，自然晾干；

   4) 120℃烤膜，30min。

3. 雜交

   1) 雜交前，將尼龍膜在6 X SSC中浸透后，轉入預雜交液中，65℃下預雜交1-2hr；

   2) 倒掉預雜液，加入變性的³²P標記的總cDNA探針，65℃下雜交16-20 hr；

   3) 分別使用高鹽buffer(2 X SSC和0.5%SDS)和低鹽buffer(0.1 X SSC和0.5%SDS)下，65℃洗膜至合適強度；

   4) 晾干后，用x-光膠片進行放射自顯影；

   5) -70℃曝光1-4天后，按常規洗片。