一、樣品1.用經過培養的并且按照血液惡性腫瘤標準細胞遺傳學程序收獲的骨髓和外周血可以得到最好的結果。 2.對于HSH研究來說，用新鮮制備的片子很重要。固定在甲醇和冰乙酸中的細胞儲存于-7.0°C中，直到 FISH 研究需要時才滴片。 3.外周血和骨髓涂片也可以用這種方法處理。 4.在對每批患者樣品研究中應該包括帶有正常和異常細胞的pH染色體陽性的對照玻片。 二、標本制備1.用相差顯微鏡掃描載玻片，定位一個包括足夠數量間期細胞的區域。這些細胞應該形態良好并且重疊細胞應該最少。如果這張載玻片不滿意，最好是準備另一張玻片而不是繼續以下操作。 2.將新制備的載玻片在65°C的烤箱中烤1h或者在90°C的烤箱中烤10min。不要延長高溫（60~90°C)烤片的時間。 3.把這張載玻片放在裝有2XSSC溶液的染色缸中，于37°C放置1h。 4.將載玻片依次放入室溫下盛有的70%、85% 和100% 的乙醇中各lmin，將載玻片脫水。氣干。 三、變性和雜交染色缸法1.對于中期分裂相研究來說，將制備好的載玻片在74°C下70% 的甲酰胺中變性Imin; 對于間期相研究來說，變性時間為2 min。 2.將制備好的載玻片依次放入室溫下盛有的70%、85% 和100% 的乙醇中各lmin，將玻片脫水。氣干。 3.取3juL的LSI?BC尺/ABL探針工作液到0.65 mL的小離心管中，離心10s。 4.將探針混合物漂在74°C的水浴中變性5 min。 5.將離心管從水浴中取出并且馬上將探針混合物加到制備好的載玻片上并且把玻片放在45°C的玻片溫箱中。 6.將一張圓形12 mm的蓋玻片放在雜交區域上。用橡皮泥封住載玻片。將制備好的載玻片放在濕盒中，37°C持續8?20 h。 7.雜交后洗脫。 HYBrite(Vysis，Inc.，DownersGrove，IL.)共變性方法1.取3uL LSI BCR/ABL 探針工作液直接加到制備好的染色體載玻片上。用圓形12 mm的蓋玻片蓋住雜交區域。用橡皮泥封住蓋玻片。 2.用水填充HYBrite槽。注意不要將槽內的水放得太滿，因為這會影響DNA變性過程。 3.設置HYBrite程序如下：融解溫度80°C，融解時間5 min，雜交溫度37°C，雜交時間20 h。 4.把載玻片放在HYBrite槽中并且讓機器執行雜交過程。 5.把載玻片從HYBrite槽中取出，進行隨后3.4的雜交后洗脫步驟。 四、雜交后洗脫1.去掉橡皮泥。仔細拿掉蓋玻片并且丟棄。 2.把載玻片放在盛有0.4XSSC的染色缸中，74°C放置2 min。 3.拿出載玻片并且把它放在盛有2XSSC/0.1%NP-40的染色缸中室溫洗滌1min。 4.把載玻片從染色缸中，玻片邊緣接觸紙巾去掉過量的2XSSC/0.1%NP-40。 5.把10ul 的DAPI-I工作液加到雜交區域上。 6.在雜交區域上放一張蓋玻片。輕壓蓋玻片去掉氣泡。準備用顯微鏡分析載玻片。 五、顯微鏡1.使用帶有100ul汞燈的高質量的熒光顯微鏡。 2.使用FITC和德克薩斯紅雙通道設置來同時觀察信號。使用FITC或德克薩斯紅單通道設置來觀察單一熒光。 3.使用帶有適當圖像分析系統軟件的計算機來捕捉需要記錄的細胞圖像。 六、評分標準1.Vysis的探針產生一個綠色信號（G)，ABL探針產生一個紅色信號(R)，背景染色質為藍色。觀察到的BCR/ABL 融合信號為紅色和綠色接觸的信號或者是一個黃色信號。本章后邊的用F來指代BCR/ABL融合信號。 2.正常的間期或中期細胞有2 紅 2 綠信號，沒有F 信號（圖 2)。 3.帶有一個 Ph 染色體的異常細胞核或者有1 紅 1 綠2F 信號，或者有2 紅 2 綠 IF 信號。帶有兩個Ph 染色體的細胞核或者有1 紅 1 綠3F信號，或者有2紅2綠2F信號。 4.帶有非典型異常I>FISH 類型的 Ph 染色體陽性的中期或間期細胞將會有 5 個或者更少的信號，至少一個融合信號。非典型信號類型包括 2紅 1 綠 IF信號，1 紅2綠 IF信號或 1 紅 1 綠 IF信號。 5.如果對于一個細胞是杏應該評分或者是否有融合信號有疑問，就不要對這個細胞評分了。 七、標本制備的分析1.在分析患者樣品之前計數 100 個細胞核作為陽性對照來確保這種方法能工作。 2.如果可能，在治療前分析 10 個或者更多的 Ph 染色體陽性的中期分裂相來建立 Ph 染色體的信號類型。了解用典型評分標準還是非典型評分標準分析間期細胞核很重要。 3.至少捕捉兩個有代表性的間期相來描述這些研究。 4.兩個觀察者應該分別從雜交位置的兩三個獨立區域中分別計數 250 個鄰近的間期細胞核。 5.如果兩個觀察者的結果區別大于 5%，第三個觀察者應該計數 250 個鄰近的細胞，或者應該考慮再雜交一次。 6.如果兩個觀察者的結果是可接受的，那么這些結果應該取均數來計算樣品中有 BCR/ABL融合信號細胞的百分數。 7.如果患者有一個典型信號類型的 Ph染色體并且結果在正常范圍內（異常細胞核小于 1%)，那么每個觀察者應該分析 6000 個細胞核中超過 2750 個細胞核來尋找最小殘留病灶。 8.捕捉載玻片上至少一個區域的圖像來描述代表最終結果的幾個細胞核。 八、結巣解釋1.有經驗的觀察者應該很少，甚至從來不會在正常樣品中觀察到假陽性信號類型的細胞核。對于這些觀察者，分析 500 個細胞核的正常切割值是小于 1%，對于 6000 個細胞核，切割值小于 0.079%。 2.有經驗的觀察者在多數未經治療的 CML 患者中應該檢測到多于 90% 的異常間期細胞。 3.帶有非典型信號類型的患者假陽性核的頻率不同。1紅2綠 IF 患者的正常切割值是 1.2%，2紅1綠 IF 患者的正常切割值是 1.8%，1紅1綠IF 患者的正常切割值是 23.0%。 九、質量控制1.任何新試劑在用于臨床前應該在對照樣品上檢測。 2.對于每一批患者的樣品應該帶一個Ph染色體陽性的對照載玻片。 3.每一個樣品應該由兩個記錄員獨立地分析，他們彼此的結果相差應在 5% 之內。 4.每個記錄員對照樣品的總結結果表格應該保存下來并且常規地對技術問題產生的趨勢進行評估。 5.應該調查所有失敗的檢測結果并且描述下來以建立問題庫。 6.生成每月的結果報告來評估檢測程序。 7.尋找更多質控的信息。 收起 | 
