我國學者使用RNA模板首次在植物中實現同源重組修復

　　近日，中國農業科學院作物科學研究所作物轉基因技術與應用創新團隊與美國加州大學圣地亞哥分校合作,使用RNA作為同源重組修復（HDR）的模板，并分別利用核酶自切割和具有RNA/DNA雙重切割能力的CRISPR/Cpf1基因編輯系統，成功獲得后代無轉基因成分的抗ALS抑制劑類除草劑水稻植株。該研究是在植物中首次成功利用RNA作為同源重組修復模板，開辟了利用植物RNA作為同源供體模板進行同源修復的新思路，是植物基因組編輯領域的重大進展。相關研究成果“Precise gene replacement in rice by RNA transcript-templated homologous recombination”于2019年3月18日在線發表在《自然生物技術（ Nature Biotechnology ）》上。

　　自2012年CRISPR/Cas基因組編輯技術被發明以來，已被廣泛應用于動物、植物和微生物等諸多物種的基因組編輯。基因組編輯首先在基因組靶向位置產生DNA雙鏈斷裂（DSB），這些產生的DSB可通過非同源末端連接（NHEJ）或者HDR途徑進行修復。NHEJ最常用于移碼突變破壞基因功能，而HDR主要被用于對靶標序列的精準替換或定點插入。在多數物種中，NHEJ是DSB最主要的修復途徑，而通過HDR途徑進行精準修復的概率特別低。HDR修復途徑需要額外提供同源重組的供體作為修復的模板，在動物中可以較容易地將CRISPR/Cas系統及同源重組供體遞送入細胞中，而在植物中，主要通過農桿菌侵染或基因槍轟擊愈傷的方式來進行CRISPR/Cas系統以及DNA供體的遞送。雖然利用基因槍轉化或者雙生病毒系統可以提高DNA模板數量進而提高HDR的發生概率，但是實現高效率的植物同源重組依然是一個巨大的挑戰，因此限制了基因組編輯的拓展應用。

　　研究人員首先利用分子生物學手段并對重組事件進行評估，證實了將RNA作為同源重組修復模板，參與CRISPR/Cpf1介導的DNA同源重組修復的可行性。與通常使用的DNA模板不同，RNA模板可以在體內通過植物自身的轉錄系統持續產生，為同源重組修復提供更多的模板。同時，選擇具有RNA/DNA雙重切割能力的CRISPR/Cpf1基因編輯系統，在細胞核內同時加工產生用于靶向目標序列的crRNA及一起轉錄的模板RNA，既產生了DSB又提供了同源重組修復的RNA模板，成功獲得OsALS兩個氨基酸定點替換成功的抗嘧啶羧酸類除草劑水稻植株，且在子代分離得到了定點替換成功且無外源轉基因成分的植株。該項成果首次證明，除了通常使用的DNA模板，RNA同樣可作為植物同源重組修復的模板。在此研究基礎上，進一步優化該策略的效率，有望解決目前植物同源重組頻率低下的難題，加速通過基因編輯技術，精準改良農作物重要農藝性狀，進而定向創制農作物新種質的育種進程。

　　該研究得到轉基因生物新品種培育重點項目、國家重點研發計劃項目、中國農科院科技創新工程項目和“農科英才”領軍人才項目的資助。