我國學者發文NATURE子刊，冠狀病毒廣譜中和抗體新機制

2022年6月30日，中科院分子細胞科學卓越創新中心、復旦大學上海醫學院及上海市公共衛生臨床中心合作，孫兵研究員、謝幼華研究員、徐建青研究員、陸路研究員、丁建平研究員與凌志洋副研究員領銜，在 Nature Microbiology 期刊在線發表了題為：Neutralization mechanism of a human antibody with pan-coronavirus reactivity including SARS-CoV-2 的研究論文。

該研究發現了一株泛冠狀病毒廣譜全人中和抗體——76E1，其不僅能有效地中和 beta 冠狀病毒屬的 SARS-CoV-2 及其重要突變體毒株，還可以中和不同冠狀病毒屬的七種人類冠狀病毒。

該抗體靶向冠狀病毒表面刺突蛋白（Spike, S）上高度保守的 S2’ 酶切位點及融合肽區域。病毒結合受體 ACE2 過程促進該表位的暴露以及 76E1 抗體結合，進而抑制 S2’ 酶切及病毒包膜和宿主胞膜的膜融合，從而抑制病毒進入宿主細胞內，達到中和病毒的目的。

冠狀病毒分為 alpha、beta、gamma 和 delta 四個屬。21世紀共爆發了三次高致病性人類冠狀病毒流行，分別為 SARS-CoV、MERS-CoV 和 SARS-CoV-2，均歸類于 beta 屬。

除此之外，幾種普通型冠狀病毒也時常在人群中流行，導致無癥狀或輕型上呼吸道感染疾病，如 alpha 屬的HCoV-229E 和 HCoV-NL63，beta 屬的 HCoV-OC43 和 HCoV-HKU1。

2019年底爆發的 SARS-CoV-2 大流行對全球經濟社會和人類健康造成重大威脅，SARS-CoV-2 突變株的不斷出現及廣泛傳播也引起世界范圍內的多輪流行。我國乃至全球已經接種的疫苗均基于 SARS-CoV-2 原始株開發，而突變體毒株已經逐漸對 SARS-CoV-2 原始株疫苗建立的免疫屏障產生了一定程度的逃逸作用，尤其是 Omicron 突變體所產生的免疫逃逸現象非常明顯。因此，如何有效的應對 SARS-CoV-2 突變是目前應對疫情最緊迫的任務。另外，人類依然要面對未來爆發新的冠狀病毒大流行的可能性。因此，開發有效的廣譜抗冠狀病毒的疫苗和藥物有重大的社會需求。

大量的臨床實踐已證明，單克隆抗體臨床干預在預防和治療病毒感染方面非常有效。雖然國內及國際上已有新冠單克隆抗體藥物上市，然而大部分已經對 Omicron 等變異株失效或療效顯著降低。

針對不斷出現的病毒突變株，一個亟待回答的科學問題是：是否能開發廣譜中和SARS-CoV-2及其突變體的抗體？這種抗體亦能對不同冠狀病毒屬的人類冠狀病毒有廣譜中和作用？其廣譜作用的機制是什么？

為了解決上述科學問題，研究者們首先用 SARS-CoV-2 S 胞外區蛋白作為誘餌，從新冠病毒感染的康復患者外周血 PBMC 中，分離了 S 蛋白特異性的記憶 B 細胞，通過基因工程技術獲得單個記憶 B 細胞來源的抗體重、輕鏈基因，并表達制備成全人源抗體。通過 ELISA 結合實驗和病毒中和實驗，篩選到一株廣譜中和抗體——76E1，其可以廣譜結合并中和 SARS-CoV-2 及其突變體毒株，包括 Alpha、Beta、Kappa、Gamma、Delta 和 Omicron。

在 hACE2 轉基因小鼠上的真病毒攻擊實驗表明，用 76E1 單抗預防和治療 SARS-CoV-2 感染時，可顯著減少體重下降和降低肺部病毒滴度。進一步，研究人員發現 76E1 單抗可以廣譜結合并中和不同冠狀病毒屬的七種人類冠狀病毒，包括 SARS-CoV、MERS-CoV、SARS-CoV-2、HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63 及 HCoV-HKU1。在乳鼠上進行的 76E1 預防和治療 HCoV-OC43 真病毒感染實驗表明，76E1 可以可顯著減少體重下降和降低腦部病毒滴度。以上實驗提示該抗體有潛在的臨床應用價值。

76E1在細胞水平對多種冠狀病毒表現泛中和活性

為了進一步研究 76E1 單抗廣譜中和冠狀病毒的分子機制，研究人員解析了 76E1 Fab/抗原多肽的晶體結構，發現 76E1 單抗主要靶向 S 蛋白的 S2' 酶切位點和融合肽區域。丙氨酸突變實驗進一步確認 R815、E819、D820、L822、F823、K825 是 76E1 的關鍵識別表位。序列比對發現，以上表位在四種冠狀病毒屬中高度保守，這是 76E1 廣譜中和能力的分子基礎。比較有意思的是，76E1 的關鍵識別表位在融合前三聚體 S 蛋白全部或部分隱藏。并且，76E1 Fab/ 抗原多肽晶體結構中的抗原多肽與融合前三聚體 S 蛋白中的相應多肽也展現出不一樣的構象。同時，親和力實驗表明 76E1 難以識別融合前三聚體 S 蛋白，而 RBD 抗體卻能很好的結合融合前三聚體 S 蛋白。以上提示 76E1 可能識別了三聚體 S 蛋白從融合前到融合后變構過程中的中間態構象。

76E1和刺突蛋白三聚體結合機制

隨后，研究者發現 S 蛋白結合受體 ACE2 過程促進了 S2' 酶切位點和融合肽的暴露，進而 76E1 結合該表位，從而抑制 S2' 酶切，阻斷病毒包膜與宿主胞膜的膜融合過程，最終抑制病毒進入宿主細胞，中和病毒。冠狀病毒利用這一策略來掩蓋它們的融合過程中的敏感位點，從而限制抗體接觸到這種敏感位點，并且僅在識別和感染宿主細胞時才將它暴露出來。

進一步的研究表明，76E1 在病毒感染后期具有很大的優勢性，即在病毒結合宿主細胞受體后，阻斷受體結合過程的 RBD 抗體失去中和活性，而 76E1依然可以中和病毒。利用以上原理，研究者發現 ACE2 蛋白與 76E1 單抗具有協同中和 SARS-CoV-2 的效果。同時，發現一些具有模仿 ACE2 功能的 RBD 抗體，如 CB6 等，與 76E1 也具有協同中和 SARS-CoV-2 的效果。這為基于抗體的抗病毒療法提供新的升級版策略。

76E1和CB6抗病毒協同作用

綜上所述，該研究發現的單抗具有更寬的廣譜中和活性，同時具有全新的中和機制。為應對 SARS-CoV-2 突變及未來新發冠狀病毒爆發提供新的抗病毒策略，同時為新一代廣譜冠狀病毒疫苗的設計提供重要參考和理論依據。

76E1抗體的作用機理

中科院分子細胞科學卓越創新中心孫曉玉博士后與伊春艷副研究員，復旦大學上海醫學院朱園飛博士后、上海市公共衛生臨床中心丁龍飛博士、復旦大學上海醫學院夏帥青年研究員及中科院分子細胞科學卓越創新中心陳星塵博士后為該論文的共同第一作者。孫兵研究員、謝幼華研究員、徐建青研究員、陸路研究員、丁建平研究員及凌志洋副研究員為本文共同通訊作者。