掃描電子顯微鏡樣品制備實驗

1. 生物樣品的精細結構易遭破壞。因此在進行制樣處理和進行電鏡觀察前必需進行固定。以使其能最大限度地保持其生活時的形態。而采用水溶性、低表面張力的有機溶液如乙醇等對樣品進行梯度脫水，也是為了在對樣品進行干燥處理時盡量減少由表面張力引起的其自然形態的變化。

2. 目前采用最多、效果最好的方法是臨界點干燥法。其原理是在一裝有溶液的密閉容器中，隨著溫度的升高，蒸發速率加快，氣相密度增加。液相密度下降。當溫度增調到某一定值時，氣、液二相密度相等，界面消失，表面張力也就不存在了。此時的溫度及壓力即稱為臨界點。將生物樣品用臨界點較低的物質置換出內部的脫水劑進行干燥，可以完全消除表面張力對樣品結構的破壞。

目前用得最多的置換劑是二氧化碳。由于二氧化碳與乙醇的互溶性不好，因此樣品經乙醇分級脫水后還需用與這兩種物質都能互溶的「媒介液」醋酸戊脂置換乙醇。

大腸桿菌斜面／懸浮液

液態二氧化碳1％～2％ 戊二醛磷酸緩沖液醋酸戊脂濃硫酸無水乙醇無菌水

普通光學顯微鏡無菌滴管無菌鑷子大頭針載玻片蓋玻片真空鍍膜機臨界點干燥儀

1. 固定及脫水

1.1 將處理好的干凈的蓋玻片，切割成 4～6 mm² 的小塊。

1.2 將待檢的較濃的大腸桿菌懸浮液滴加其上，或將菌苔直接涂上，也可用蓋玻片小塊粘貼菌落表面，自然干燥后置光學顯微鏡鏡檢，以菌體較密，但又不堆在一起為宜；

1.3 標記蓋玻片小塊有樣品的一面；

1.4 將上述樣品置于 1％～2％ 戊二醛磷酸緩沖液（pH7.2 左右）中，于 4 ℃ 冰箱中固定過夜。

1.5 次日以 0.15％ 的同一緩沖溶液沖洗，用 40％、70％、90％ 和 100％ 的乙醇分別依次脫水，每次 15 min。

1.6 脫水后，用醋酸戊脂置換乙醇。

2. 干燥

將上述制備的樣品置于臨界點干燥器中，浸泡于液態二氧化碳中，加熱到臨界點溫度（31.4 ℃， 72.8 個大氣壓）以上，使之氣化進行干燥。

3. 噴鍍及觀察

將樣品放在真空鍍膜機內，把金噴鍍到樣品表面后，取出樣品在掃描電鏡中進行觀察。

樣品經脫水后，有機溶劑排擠了水分，侵占了原來水的位置。水是脫掉了，但樣品還是浸潤在溶劑中，還必需在表面張力盡可能小的情況下將這些溶劑「請」出去，使樣品真正得到干燥。

另一種與之類似的樣品制備方法是采用離心洗滌的手段將菌體依次固定及脫水，最后涂布到玻片上。

其優點是：

1. 在固定及脫水過程中可完全避免菌體與空氣接觸，從而可最大程度地減少因自然干燥而引起的菌體變形。

2. 可保證最后斜成的樣品中有足夠的菌體濃度，因為涂在玻片上的菌體在固定及干燥過程中有時會從玻片上脫落。

3. 確保玻片上有樣品的一面不會弄錯。